新疆地區MTHFR基因C677T多態性與男性嚴重少精子癥的相關性分析

左亞軍 艾熱提·阿皮孜 邵為民 張金可 陳滌平

新疆醫科大學第一附屬醫院泌尿外科中心（烏魯木齊 830000）

近些年有關研究表明育齡中約有15%男女受到不孕不育的困擾，其中男女患病比例基本相等，大約各占一半[1]。雖然目前各種診斷手段不斷出現，但仍有約40%～50%的男性不育原因不明[2]。精液質量決定著男性的生育能力，近年來基因與精液質量的關系是臨床學者研究的熱點。現研究表明，亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）在機體內不可逆的催化葉酸發生生化反應，其可直接影響機體對葉酸的利用及代謝，葉酸的代謝對于細胞的正常功能是至關重要的，其參與了甲硫氨酸的生產過程及嘌呤和嘧啶的合成。因此合成該酶的相關基因的改變可能會影響精子的發生。同時也有一些研究提示MTHFR基因多態性可能有民族或地理上的差異，而這種多態性對男性生育能力的影響也可能受到某些其他因素的制約，比如環境因素、飲食習慣以及營養狀況等[3,4]。本次研究主要分析新疆地區MTHFR基因C677T多態性與嚴重少精子癥不育男性患者是否存在關聯，探討該基因多態性對嚴重少精子癥患者的影響。

資料與方法

一、研究對象

1. 病例組：選取2017年上半年就診于新疆醫科大學第一附屬醫院生殖助孕與泌尿男科的中重度少精子癥患者154人，漢族，年齡22～45歲；對照組：以同一時間段就診于我院經精液分析且精液質量正常的294例男性。

2. 納入標準為：禁欲2～7d，手淫取精，精液常規分析確定為中重度少精子癥（5×106/mL＜精子密度＜10×106/mL為中度少精子癥；精子密度＜5×106/mL為重度少精子癥）。

3. 排除標準：（1）染色異常（包括核型、Y染色體微缺失）；（2）存在精索靜脈曲張；（3）有隱睪的病史；（4）生殖系統嚴重感染或手術史；（5）病毒性腮腺炎的病史；（6）長期吸煙史；（7）明顯的環境污染物暴露（重金屬接觸、放射化學物質等接觸）史。

二、基因分析方法

1. 標本采集：對所有研究對象抽取靜脈血，裝于特定的抗凝管（含有乙二胺四乙酸二鈉（EwDTA-2NA）中， 并全血保存于特定溫度的冰箱里。

2. 血液基因組DNA提取：購買上海百敖科技股份有限公司生產的血液基因組DNA抽提試劑盒提取全血基因組DNA。

3. 純度和濃度檢測：使用瓊脂糖凝膠電泳的方法估計所提取DNA的濃度和純度。

4. 購買相關試劑盒：采用PCR（購自美國應用生物系統公司）一熒光探針法定性檢測MTHFR C677T多態性位點基因型。

三、統計學方法

使用SPSS 22.0軟件，將計算的兩組等位基因和基因型頻率進行比較并采用x2檢驗進行統計學分析。檢驗水準（α）為0.05，P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

MTHFR C677T在病例組與對照組基因型及等位基因頻率比較[n(%)]，見表1。

表1 MTHFR C677T在病例組與對照組基因型及等位基因頻率比較[n(%)]

表1中顯示：病例組和對照組TT基因型構成比及等位基因分布及頻率比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。對照組中CC型基因頻率（32.3%）明顯高于病例組（21.4%），對照組TT型基因頻率（20.8%）明顯小于病例組（42.3%)，差異均具有統計學意義（P＜0.05；OR=2.926，95%CI=1.721～4.975）；兩組等位基因C、T進行比較[視CC型基因（野生型）為2個C等位基因，CT型基因（雜交型）為1個C等位基因和1個T等位基因，TT型基因（純合突變型）為2個T等位基因]，差異也均具有統計學意義（P＜0.05；OR=1.847，95%CI=1.396-2.443）。在基因型為CT的病例組與對照組比較（P＞0.05，OR=1.231，95%CI=0.747～2.029），差異不具有統計學意義。OR是暴露因素與疾病發生之間的聯系強度，其數值越大，提示該基因與嚴重少精子癥發生之間的相關性越強。本研究分析結果提示：MTHFR基因多態性的TT型基因及T等位基因可能是嚴重少精子癥的危險因素。

討 論

人類MTHFR基因首先由Montjean等[5]成功克隆，并且被定位于第1號染色體短臂（1p36.3)，cDNA長2.2 kb，該基因包含著約有21個基因編碼序列，包括外顯子11個和內含子10個，全長為7105 bp的tuRNA，其氨基酸序列高度保守。在目前發現的MTHFR基因10余種基因突變的類型中，基因C677T的點突變最為常見，即突變基因外顯子中的第677個核苷酸由C突變為T，該基因編碼改變致使體內該基因密碼子編輯的的丙氨酸變為纈氨酸，該突變可產生3種基因類型：野生型（即CC基因型）、雜交型（即CT基因型）和純合突變型（即TT基因型），也有一些相關研究表明，該基因的突變致使MTHFR的活性存在不同程度的降低[6,7]，使葉酸在甲硫氨酸代謝循環中的作用喪失或降低。

MTHFR在體內葉酸代謝中的生化作用主要是影響DNA合成與甲基化。在全球人類基因組677 T的甲基化低于677 C基因[8]，而DNA低甲基化從而引起相關基因的表達，而且會誘導尿嘧啶在DNA合成發生錯誤，最終導致DNA的修復出現錯誤、DNA鏈的斷裂及出現染色體異常。在葉酸利用的過程中也維持體內同型半胱氨酸的動態平衡，從而避免同型半胱氨酸在體內堆積，而引起高同型半胱氨酸血癥（hyperhornocysteinemia，Hhcy）[9]。Zetterberg等[10]研究同樣表明，MTHFRC677T的多態性的純合子（TT基因型）與雜合子（CT基因型）分別和野生型相比，更可能存在高同型半胱氨酸血癥。在細胞生理學上的MTHFR突變是自動氧化的，導致有毒活性氧代謝物的產生，人類精子極易受到氧化損傷及抗氧化劑的影響，葉酸的充分利用可克服氧化應激對精子的損害，以保持DNA的完整性。因此，除了甲基化作用外，同型半胱氨酸介導的DNA氧化損傷可能是男性不育的另一種機制。同時有些研究表明，MTHFR基因多態性有可能通過基因多態性影響酶的活性[11]引起高同型半胱氨酸血癥而導致睪丸生精功能受損導致男性不育[12]。

目前有很多項目對MTHFR基因都有著很深刻的研究，在動物實驗中，Zhou等研究[13]顯示該基因在睪丸的表達明顯高于肝臟等其他器官，提示該基因的表達可能與精子的發生有密切的關系，同時也有一些對MTHFR基因敲除后的實驗[14]，基因敲除后的小鼠出現了精子生成嚴重受到影響，并喪失了生育的能力，證實了MTHFR基因參與了雄性生殖過程，并在其中起到重要作用。有些關于MTHFR基因的多態性的研究表明，該基因的多態性可能通過影響精原細胞DNA復制過程的甲基化而影響精子的發生。如Song等[15]通過外界給予生物制劑脫氧胞苷類似物抑制小鼠的DNA甲基化，發現小鼠睪丸產生的精子活力及受孕能力有著顯著的下降。Chan 等[16]運用小鼠建立的動物模型發現，MTHFR敲除的白色變種實驗室雄性小鼠出現了睪丸功能障礙的癥狀及無法生育，檢測發現其精子中印跡基因的甲基化出現了嚴重的混亂。這也更加驗證了精子的發生與MTHFR基因相關。

同時，一些研究還發現MTHFR基因的多態性中各基因型的分布頻率在不同國家也有所不同[17,18]。在對于MTHFRC677T多態性與男性不育相關性的研究中，亞洲人群與歐洲人群的報道結果不盡相同，亞洲部分國家[19]和我國部分地區[20]相關研究中提示存在相關性，而歐洲部分國家的相關性研究[21]顯示差異無統計學意義，無相關性，其中原因還需要進一步的探討。

本研究結果提示：男性嚴重少精子癥患者與對照組TT基因型和等位基因分布及頻率比較，差異具統計學意義（P＜0.05）。MTHFR的TT基因型及T等位基因可能是嚴重少精子癥的危險因素。這與國內的一些研究[22,23]結果一致。本研究對于MTHFR基因的多態性與男性不育的相關性做了初步的研究，其作用的機制還需要更進一步的探討，此次研究為疾病診斷提供了初步思路和線索，對疾病治療方案的制定有一定的幫助。但本次的研究所收集的病例較少，且未進行分層分析，故具有一定局限性，此后還需進一步深入探討。