不同提取方法對牡丹籽油品質(zhì)與抗氧化性的影響

趙優(yōu)萍，張沙沙，張 婷，孫盧狄，肖金妮，蔡成崗，2，3，方 晟，肖竹錢，2，3，沙如意，2，3，毛建衛(wèi)，2，3，*

(1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310023;2.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310023;3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310023;4.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院，浙江紹興312000)

牡丹(Paeonia suffruticosa)別稱木芍藥，有“花中之王”稱號，是我國特有的木本花卉。牡丹為毛莨科芍藥屬落葉灌木，可分為觀賞牡丹和藥用牡丹。觀賞牡丹主要在河南洛陽和山東菏澤廣泛種植，而藥用牡丹以安徽銅陵的“鳳丹”最為著名［1］。牡丹籽是牡丹植株的精華結(jié)晶，其提取物含有大量人體需要的氨基酸、維生素和不飽和脂肪酸等活性成分，但是目前牡丹籽作為牡丹花和丹皮的副產(chǎn)物，一直未得到合理的開發(fā)和利用［2］。牡丹籽油是衛(wèi)生部公布的一種木本食用油，富含油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸，特別是α－亞麻酸，是人體必需的脂肪酸，在體內(nèi)可代謝生成二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)，還具有降血脂、預(yù)防心腦血管等疾病的重要生理功能［3－6］。牡丹籽油除含有大量不飽和脂肪酸外，還含有β－谷甾醇和角鯊烯等活性成分［7］，開發(fā)利用前景廣闊。

目前，用于植物油提取的主要方法包括機(jī)械壓榨法、超臨界CO2萃取法、亞臨界流體萃取法、超聲波輔助提取法和有機(jī)溶劑浸提法等［8］。易軍鵬等［9］、史國安等［10］對牡丹籽油的超臨界CO2萃取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，牡丹籽油得率分別為24.22%和28.86%。超臨界CO2萃取法的提取效率高，且能有效保留活性成分，但生產(chǎn)成本較高。機(jī)械壓榨法分為熱榨法和冷榨法，熱榨法至今仍普遍使用，尤其是民間作坊，提取率高，但高溫導(dǎo)致生物活性物質(zhì)大量損失，所得油脂基本屬于低檔食用油［11］。冷榨法是在低溫下物理壓榨制取油脂，營養(yǎng)成分保留較完整，但提取率相對較低。白章振等［12］分析了超臨界CO2萃取法、冷榨法和有機(jī)溶劑浸提法提取的牡丹籽油，發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑浸提法的出油率最高，可達(dá)28.61%，超臨界CO2萃取法次之，冷榨法最低，為19.14%，表明提取方式對牡丹籽油的理化特性存在較大影響，但對脂肪酸組成及相對含量無顯著影響。目前在工業(yè)生產(chǎn)中主要應(yīng)用有機(jī)溶劑浸提法，但有機(jī)溶劑浸提法存在溶劑殘留等問題;機(jī)械壓榨法通過物理機(jī)械作用制油，操作簡單、無溶劑污染，且制得的油品質(zhì)好。本實(shí)驗(yàn)以‘鳳丹’牡丹籽為試材，應(yīng)用兩種機(jī)械壓榨法——瞬時(shí)壓榨法和液壓法提取牡丹籽油，與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑浸提法進(jìn)行比較，分析三種不同提取方式對牡丹籽油提取率及品質(zhì)特性的影響;同時(shí)對牡丹籽油的抗氧化性進(jìn)行研究，以期為牡丹籽油及其他功能油脂的深入開發(fā)和利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

‘鳳丹’牡丹籽，顆粒飽滿均勻，水分含量4.10%

由河北保定太行山油用牡丹基地提供;中級初榨橄欖油 由北京市品利食品有限公司提供;雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)－三甲基氯硅烷(TMCS)(體積比99∶1) 為色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;其他化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純。

RE－2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;UV－5500PC型紫外分光光度儀 上海元析儀器有限公司;DFT－100型藥用粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;DSH－50A－1型水分測定儀 上海佑科儀器儀表有限公司;DD85G型瞬時(shí)壓榨機(jī) 德國KOMET公司;QYZ－550型液壓榨油機(jī) 泰安市良君益友機(jī)械有限公司;Allegin X－12R臺式大容量冷凍離心機(jī) 杭州合眾生物科技有限公司;7890A－5975C型氣相－質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC－MS) 鄭州中譜儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹籽油的提取

1.2.1.1 正己烷浸提法 參考劉建華等［13］的方法，取20 g牡丹籽于高速粉碎機(jī)中粉碎3 min，并置于80℃烘箱中干燥1 h。以正己烷為溶劑，將粉碎烘干后的牡丹籽置于索氏提取器中回流提取6 h，料液比為1∶18 g/mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑得到牡丹籽油，計(jì)算出油率。

1.2.1.2 瞬時(shí)壓榨法 參考陳玉宏等［11］的方法，安裝瞬時(shí)壓榨機(jī)加熱套，設(shè)定溫度為90℃，預(yù)熱15 min后取下加熱套并關(guān)閉加熱開關(guān)，加入80℃烘干1 h的粉碎牡丹籽進(jìn)行壓榨，將壓榨所得毛油經(jīng)過濾離心，得到粗牡丹籽油，儲存于4℃冰箱中待用，并計(jì)算出油率。

1.2.1.3 液壓壓榨法 參考郭剛軍等［14］的方法，將牡丹籽粉碎，80℃下烘干1 h。將處理過的牡丹籽置于液壓榨油機(jī)中壓榨3 h，壓榨溫度為70℃，壓力為50～60 MPa。收集牡丹籽油儲存于4℃冰箱中待用，并計(jì)算出油率。

1.2.1.4 出油率與殘油率計(jì)算 出油率和殘油率的計(jì)算公式如下:

式中:m1為殘留牡丹籽油質(zhì)量(g);m2為試樣質(zhì)量(g)。

1.2.2 牡丹籽油理化特性檢測 酸值測定參考GB 5009.229－2016《食品中酸價(jià)的測定》［15］;過氧化值測定參考 GB 5009.227－2016《食品中過氧化值的測定》［16］;碘值測定參考 GB/T 5532－2008《動植物油脂碘值的測定》［17］;皂化值測定參考 GB/T 5534－2008《動植物油脂皂化值的測定》［18］;水分及揮發(fā)物含量測定參考GB 5009.236－2016《動植物油脂水分及揮發(fā)物的測定》［19］;透明度、氣味、滋味測定參考 GB/T 5525－2008《植物油脂透明度、氣味、滋味鑒定法》［20］。1.2.3 牡丹籽油脂肪酸含量檢測 硅烷化:稱取樣品油脂0.2～0.3 g于50 mL離心管中，加入2 mol/L氫氧化鉀－甲醇溶液6 mL混勻，室溫下超聲提取10 min，后于60℃烘箱中皂化1 h。取出漩渦混合2 min，冷卻至室溫。加入4 mL水和6 mL正己烷，漩渦混合提取5 min，4500 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相至玻璃試管中，加入1.5 g無水硫酸鈉，靜置至澄清透明。轉(zhuǎn)移全部上清液于15 mL具塞玻璃離心管中，25℃下氮?dú)獯蹈伞＜尤?00μL硅烷化試劑BSTFA－TMCS(體積比為99∶1)，密封后于70℃烘箱中反應(yīng)30 min，再加入1 mL正己烷溶解，用0.45μm微孔濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

色譜條件:HP－5MS(30 m×0.25μm)毛細(xì)管柱;升溫程序:柱子初始溫度100℃，保持1 min;以5℃/min升至200℃，保持2 min;再以3℃/min升

式中:m1為牡丹籽油質(zhì)量(g);m2為試樣質(zhì)量(g)。至280℃，保持3 min;載氣為高純氦;進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比1∶25;進(jìn)樣量為1μL。

質(zhì)譜條件:電離方式為電子轟擊離子源(EI源);電子能量70 eV;傳輸線溫度280℃;離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃;溶劑延遲2.6 min;全掃描模式(SCAN)，掃描范圍 50～1000 u;NIST 譜庫［21－22］。

1.2.4 牡丹籽油抗氧化性檢測

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力 參考Larrauri等［23］和 Cheng 等［24］的方法加以改進(jìn)。取一定體積牡丹籽油于10 mL離心管中，加乙酸乙酯至1 mL，加120μmol/L DPPH－乙酸乙酯溶液4 mL。混勻靜置30 min后用乙酸乙酯做參照，在517 nm下測定其吸光度Ai，同時(shí)測定DPPH－乙酸乙酯溶液與1 mL乙酸乙酯混合液的吸光度A0以及一定牡丹籽油加乙酸乙酯至5 mL的混合液吸光度B。以橄欖油為對照，根據(jù)式(3)計(jì)算清除率(%):

式中:Ai為加牡丹籽油反應(yīng)后DPPH溶液的吸光度;A0為不加牡丹籽油，只加DPPH溶液的吸光度;B為不加DPPH溶液時(shí)，牡丹籽油在517 nm波長下的吸光度。

1.2.4.2 羥基自由基 配制不同濃度的樣品液，取一定體積梯度的牡丹籽油溶于1 mL無水乙醇中，混勻，充分溶解，10000 r/min離心10 min，取上清液100μL于10 mL試管中，加入5 mL無水乙醇，充分混勻，待測。

在10 mL試管中依次加入PBS緩沖液(pH=7.4)、鄰菲羅啉乙醇溶液、去離子水、FeSO4溶液(0.75 mmol/L)，加入雙氧水(0.01%)和牡丹籽油樣品液啟動 Fenton反應(yīng)。按表1順序加入各溶液［25－27］。

反應(yīng)體系置于37℃恒溫水浴中，反應(yīng)3 h，反應(yīng)完全后立即取出并測定其在536 nm處的吸光度，以去離子水為參比。以橄欖油為對照，按式(4)計(jì)算羥基自由基的清除率:

式中:Ai為牡丹籽油樣品液的吸光度;A0為不含樣品液和雙氧水的吸光度;B為只含雙氧水的吸光度。

1.2.4.3 牡丹籽油防曬性能檢測 取牡丹籽油1 mL，加入10 mL環(huán)己烷，混勻。采用紫外分光光度計(jì)法，以環(huán)己烷為參比，測定樣品在波長為200～800 nm處的吸光度，對照組為橄欖油［28－30］。

表1 加入溶液的種類和體積Table 1 Type and volume of the reagents added

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為Mean±SD，采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件和Origin 8.6軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，并采用Duncan’s multiple rang test進(jìn)行組間顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取牡丹籽油的出油率比較

正己烷浸提法、瞬時(shí)壓榨法和液壓法提取牡丹籽油的出油率分別為31.26% ±1.74%、14.27% ±0.72%和7.81% ±0.15%，如表2所示，與正己烷浸提法相比，液壓法和瞬時(shí)壓榨法的出油率均顯著性低于浸提法，且液壓法也顯著低于瞬時(shí)壓榨法(p＜0.05)。液壓法為目前生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的方法，本次結(jié)果表明該法出油率最低，主要是因?yàn)槟档ぷ演^為堅(jiān)硬，裝入物料袋后壓榨接觸面積較大，之后通過外加60 MPa壓力不斷榨取油脂，提取率為7.81%±0.15%，且物料的粉碎程度也可能影響出油率，需要后續(xù)進(jìn)一步分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該法的殘油率約20%，顯著高于瞬時(shí)壓榨法和正己烷提取法，與出油率結(jié)果成反比。瞬時(shí)壓榨法為本實(shí)驗(yàn)探索的新方法，是通過螺旋推動物料至固定位置，瞬時(shí)擠壓將油脂分子從牡丹籽細(xì)胞中分離出來，殘留率接近10%。這兩種方法均為物理壓榨，無法將油脂徹底提取出來。正己烷浸提法作為傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取法，提取時(shí)間久，提取比較完全，其出油率可近似看作牡丹籽的含油量，文獻(xiàn)報(bào)道該方法提取率在29%～34%之間，其差異主要與牡丹籽品種和含水量不同有關(guān)。

表2 不同提取方法對牡丹籽出油率的影響(%)Table 2 Effects of different methods on Paeonia suffruticosa seed oil extraction rate(%)

2.2 不同方法提取牡丹籽油理化特性比較

三種不同提取方法制取的牡丹籽油的主要理化特性指標(biāo)如表3所示。

由表3可知，3種不同方法提取的牡丹籽油的理化特性略有不同。正己烷浸提法得到的牡丹籽油水分及揮發(fā)物含量最大，為8.43%，主要為正己烷殘留;液壓法提取的牡丹籽油水分及揮發(fā)性物質(zhì)含量為6.61%，液壓法為純物理壓榨，壓榨過程全封閉，水分和油脂同時(shí)提取出來，因此水分及揮發(fā)性物質(zhì)含量較高;瞬時(shí)壓榨牡丹籽油由螺旋壓榨所得，壓榨溫度為80℃，在提取過程中，水分及揮發(fā)性物質(zhì)不斷減少，僅0.05%。瞬時(shí)壓榨法和液壓法制得的牡丹籽油酸值均較小，符合食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(植物原油酸值＜4.0 mgKOH/g)，正己烷浸提法用時(shí)久，長時(shí)間暴露在空氣中，活性成分易被破壞，酸敗程度較高。三種提取方法所得牡丹籽油的過氧化值均符合標(biāo)準(zhǔn)，其中碘值無顯著性差異，皂化值各組間差異顯著，如表3所示。瞬時(shí)壓榨法所得牡丹籽油略有混濁，是由于壓榨過程中混入細(xì)微物料過濾不徹底造成。兩種壓榨牡丹籽油均具有牡丹籽油特有氣味，而正己烷浸提法所得牡丹籽油香味較淡，可能是由于索氏提取過程中揮發(fā)性物質(zhì)的損失所致。

表3 不同提取方法制取的牡丹籽油理化指標(biāo)Table 3 Physical and chemical characteristics of Paeonia suffruticosa seed oil extracted by different extraction methods

2.3 不同方法提取牡丹籽油的成分分析

圖1 瞬時(shí)壓榨牡丹籽油成分硅烷總離子流圖譜Fig.1 Total ion current chromatogram of fatty acids in Paeonia suffruticosa seed oil by instant press method

分別將3種牡丹籽油用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定，得到其總離子流圖譜，進(jìn)一步利用NIST98標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，確定了3種牡丹籽油的主要成分組成，并采用峰面積歸一化法計(jì)算得到各組分的相對含量。由表4可知，3種方法提取的牡丹籽油主要成分為脂肪酸、角鯊烯和β－谷甾醇，其中脂肪酸占70%以上。據(jù)GC－MS結(jié)果分析，3種牡丹籽油中脂肪酸以不飽和脂肪酸為主，其相對含量為72.30%～87.47%，其中瞬時(shí)壓榨牡丹籽油亞麻酸含量最高，占總脂肪酸的30.98%，其次是液壓牡丹籽油(23.22%)，正己烷浸提牡丹籽油最低，僅15.98%;油酸和亞油酸含量則是正己烷浸提牡丹籽(43.04%，14.00%)＞液壓牡丹籽油(28.49%，15.62%)＞瞬時(shí)壓榨牡丹籽油(30.33%，8.21%)。正己烷浸提牡丹籽油所含β－谷甾醇遠(yuǎn)小于其他兩種牡丹籽油，主要是因?yàn)樗魇教崛r(shí)間長導(dǎo)致的β－谷甾醇損失。同時(shí)，3種方法對角鯊烯含量并無顯著影響(p＞0.05)。

表4 不同提取方式制得牡丹籽油主要組成質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)Table 4 Composition quantity percentage of Paeonia suffruticosa seed oil extracted by different methods(%)

圖2 液壓牡丹籽油成分硅烷總離子流圖譜Fig.2 Total ion current chromatogram of fatty acids in Paeonia suffruticosa seed oil by hydraulic press method

圖3 正己烷浸提牡丹籽油成分硅烷總離子流圖譜Fig.3 Total ion current chromatogram of fatty acids in Paeonia suffruticosa seed oil by n－h(huán)exane extraction method

2.4 不同方法提取牡丹籽油抗氧化性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力 不同提取方法制得的牡丹籽油對DPPH自由基的清除能力如圖4所示，隨著牡丹籽油體積濃度的升高，DPPH自由基清除能力也隨之提高。當(dāng)牡丹籽油體積濃度為40μL/mL時(shí)，三種牡丹籽油的清除率均達(dá)到最大值，其中瞬時(shí)壓榨法與正己烷浸提法所得牡丹籽油的清除率高于對照組橄欖油，可達(dá)99%，而液壓法低于對照組，且與其他兩種方法有極顯著性差異(p＜0.01)。同時(shí)以圖4中差異較大的12μL/mL和36μL/mL油脂用量進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明在12μL/mL時(shí)正己烷浸提法與其他兩種方法有極顯著性差異((p＜0.01);在36μL/mL時(shí)液壓法與其他兩種方法有極顯著性差異(p＜0.01)。

圖4 牡丹籽油對DPPH自由基清除作用的體積濃度－效應(yīng)關(guān)系Fig.4 Volume concentration effect relationship of DPPH free radical scavenging effect of Paeonia suffruticosa seed oil

2.4.2 羥基自由基清除能力 羥基自由基是多數(shù)氧自由基的母體，可衍生出多種自由基。氧自由基均具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可損傷細(xì)胞膜及細(xì)胞DNA［32］。羥基自由基清除率是反映油脂抗氧化作用的重要指標(biāo)。不同牡丹籽油對羥基自由基的清除能力如圖5所示，隨著牡丹籽油體積濃度的增加，其對羥基自由基的清除能力逐漸提高，浸提牡丹籽油和液壓牡丹籽油的清除率在2.4和3.0μL/mL時(shí)達(dá)到最大，分別為38.46%和36.82%，瞬時(shí)壓榨油對羥基自由基最高清除率僅20.56%。在體積濃度達(dá)一定值后，清除率反而下降，是由于油脂濃度過大，反應(yīng)體系不穩(wěn)定，形成乳濁液所致。但與對照組橄欖油相比，在相同體積濃度下，如以1.0和2.4μL/mL兩組為例，牡丹籽油的羥基自由基清除率顯著高于橄欖油(p＜0.01)。

圖5 牡丹籽油對羥基自由基清除作用的體積濃度－效應(yīng)關(guān)系Fig.5 Volume concentration effect relationship of Paeonia suffruticosa seed oil on hydroxyl radical scavenging effects

2.4.3 防曬性能分析 由圖6可知，在200～270 nm的波長區(qū)間，三種牡丹籽油的吸光度基本一致，而從270～450 nm區(qū)間，液壓牡丹籽油的吸光度明顯高于其他兩種牡丹籽油。UVB紫外線(275～320 nm)可透射到人體皮膚的表皮層，能促進(jìn)人體礦物質(zhì)代謝和維生素D的形成，但長期或過量照射會導(dǎo)致皮膚紅斑、紅腫脫皮等。UVA紫外線(320～400 nm)具有很強(qiáng)的穿透力，可直達(dá)皮膚真皮層，破壞彈性纖維和膠原蛋白纖維，造成皮膚黑化、皺化、老化等，甚至出現(xiàn)癌變［31］。由結(jié)果可知，液壓牡丹籽油在270～450 nm 范圍內(nèi)吸光度值高于其他兩種方法，表明了良好的防曬效果;在450 nm之后，液壓牡丹籽油和正己烷浸提牡丹籽油的吸光度值略高于瞬時(shí)壓榨牡丹籽油，綜合防曬效果以液壓法最佳。

圖6 不同方法制得牡丹籽油防曬性能比較Fig.6 Comparison of sunscreen performance of Paeonia suffruticosa seed oil by different methods

3 結(jié)論

牡丹籽作為新型油料，在功能油脂方面具有較高的開發(fā)價(jià)值。采用瞬時(shí)壓榨法、液壓法和正己烷浸提法提取牡丹籽油，結(jié)果表明，正己烷浸提法(31.26%)可以獲得較高的出油率，但瞬時(shí)壓榨法(14.27%)和液壓法(7.81%)更加綠色安全，無溶劑殘留。在理化性質(zhì)方面，瞬時(shí)壓榨法和液壓法所得牡丹籽油相差不大，正己烷浸提法因氧化而導(dǎo)致酸值過高，油脂品質(zhì)較差。由于3種提取方法的原理不同，造成油脂主要成分的組成含量差異顯著，瞬時(shí)壓榨牡丹籽油和液壓牡丹籽油亞麻酸和β－谷甾醇含量較高。在體外抗氧化方面，3種牡丹籽油對DPPH自由基的清除率相近，液壓牡丹籽油較低;液壓法和正己烷浸提所得牡丹籽油對羥基自由基的清除率表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢;液壓牡丹籽油較其他兩種牡丹籽油在防曬性能方面較好。通過上述指標(biāo)的顯著性分析以及綜合不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)分析可知，瞬時(shí)壓榨法和液壓法作為冷榨法，可用于提取綠色高品質(zhì)的牡丹籽油，在實(shí)際生產(chǎn)中可先采用瞬時(shí)壓榨法或液壓法進(jìn)行高活性成分牡丹籽油的提取，其油餅可進(jìn)一步利用正己烷浸提，以提高綜合提取率，提高牡丹籽油的利用率。