酶法預處理對花生油脂體穩定性的影響及酶法破乳工藝優化

趙自通，陳復生，周龍正

(河南工業大學糧油食品學院，河南鄭州450001)

花生種植歷史悠久，早在公元前2000年左右南美洲地區就有人開始種植花生，隨后輾轉傳播到世界各地［1］。目前花生已經是世界上主要油料作物之一，而我國的花生產量占全世界花生總產量的40.8% ，位居世界第一［2－3］?；ㄉ蜖I養價值豐富、色澤清亮、滋味可口，是我國人民日常生活中必不可少的食用油。但是傳統的壓榨法和浸出法取油都是以提取得到更多的油脂為導向，得到的花生蛋白變性嚴重，功能性質明顯下降，限制了其在食品工業中的應用［4－5］。

隨著科技的發展，酶制劑的生產成本不斷降低，而且由于酶制劑的高效專一、反應條件溫和、安全環保等優點，非常符合當前我國倡導的綠色可持續發展的要求，使得酶制劑在食品工業中的應用愈加廣泛［6－7］。因此，為了減少油料資源的浪費，使油料資源的利用更加安全綠色、可持續發展，研究人員在水劑法的基礎上提出了提取條件溫和、綠色、安全，且可以同時得到花生蛋白和油脂的水酶法提取工藝。

水酶法是在對油料進行機械破碎的基礎上，利用酶制劑來降解植物油料細胞的細胞壁及其內部結構，再以水為溶劑利用非油成分(蛋白質和碳水化合物)對油和水的親和力差異，以及油水比例的差異將油和非油成分進行分離的技術［8］。但是由于存在一些限制因素的影響，使得大多數油料的水酶法提取工藝都處在理論研究階段，并沒有得到大規模得工業化應用。其中水酶法乳狀液的破乳是限制其工業化應用的一個關鍵因素，這是由于在水酶法萃取體系中同時存在大量的油脂和蛋白質，造成乳化現象嚴重難以破乳［9］。因此，研究如何解決水酶法工藝過程中的破乳難題對水酶法的推廣應用至關重要。而且目前關于水酶法提油及蛋白研究中使用的酶制劑基本都是蛋白酶或者蛋白酶與其他酶類的復配，在提取過程中由于蛋白酶的水解作用，所得到的蛋白產品為蛋白質水解產物，限制了花生蛋白在食品工業中的應用。

本研究在傳統花生水酶法工藝基礎上進行改進，先使用復合植物水解酶先將花生中的油脂體和花生蛋白分離，然后對花生油脂體破乳工藝進行優化得到花生油脂，以期為水酶法提取工藝提供新的思路，促進水酶法提取技術的工業化應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生(開農1715) 河南省開封市農林科學研究院;復合植物水解酶(Viscozyme L) 丹麥諾維信(北京)有限公司;木瓜蛋白酶(酶活:800 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

BT－9300H型激光粒度分布儀 遼寧丹東市百特儀器有限公司;FW－100型高速萬能粉碎機 北京市永光明醫療儀器有限公司;BSA224S－CW型分析天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;THZ－82型數顯水浴恒溫振蕩器 金壇華峰儀器有限公司;K1100型全自動凱氏定氮儀 山東濟南海能儀器股份有限公司;FM200型均質機 上海弗魯克流體機械制造有限公司;LGJ－25型低速冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司;TDL－5A型離心機 上海安亭科學儀器廠;CX41型光學顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生油脂體的提取方法 將脫紅衣花生用高速萬能粉碎機粉碎10 s，稱取粉碎后的花生20 g，按料液比1∶3.5加去離子水，均質5～10 s(轉速7800 r/min)使樣品充分混勻后加入復合植物水解酶。在52℃水浴恒溫振蕩器中振蕩提取90 min，充分酶解。酶解結束后于沸水浴中滅酶5 min，取出后冷卻。將冷卻后的樣液轉移至離心管以5000 r/min離心20 min。分別得到上層油脂體、水相和下層沉淀。取出上層油脂體置于4℃冰箱中備用(樣品放置時間不能超過24 h)。復合植物水解酶提取花生油脂體的工藝流程如圖1所示。

圖1 復合植物水解酶提取花生油脂體工藝流程圖Fig.1 Flowchart for extracting peanut oil bodyby Viscozyme L

1.2.2 花生及油脂體基本成分的測定 花生及油脂體油脂含量測定:參照GB/T 5009.6－2016中的索氏抽提法測定花生及油脂體的油脂含量;花生及油脂體蛋白含量的測定:參照GB/T 5009.5－2016中蛋白質的測定方法，利用全自動凱氏定氮儀測定花生及油脂體的蛋白含量;花生及油脂體水分含量的測定:參照GB/T 5009.3－2016中的直接干燥法測定花生及油脂體的水分含量。

1.2.3 預處理對花生油脂體穩定性的影響

1.2.3.1 粉碎時間對花生油脂體穩定性的影響 取100 g脫紅衣花生分別于萬能粉碎機中粉碎5、10、15、20、25、30 s，按照 1.2.1 中的方法提取花生油脂體，參考 Hao等［10］的方法將油脂體按 1∶10(g/mL)稀釋于純水，充分振蕩混勻后，將激光粒徑分析儀調整到自動測試模式，分析樣品粒徑分布。

1.2.3.2 烘烤溫度對花生油脂體穩定性的影響 取100 g未脫紅衣花生，放入烘箱中分別在60、80、100、120、140、160℃條件下進行烘烤后冷卻脫紅衣，按照1.2.1中的方法提取花生油脂體后將油脂體按1∶10(g/mL)稀釋于純水，充分振蕩混勻后，將激光粒徑分析儀調整到自動測試模式，分析樣品粒徑分布。同時將油脂體稀釋10倍，在數碼顯微鏡下進行觀察拍照。

1.2.4 破乳方法 參考趙翔等［11］的方法取適量油脂體于50 mL離心管中，以一定比例的去離子水稀釋，加入一定量的木瓜蛋白酶，將樣品置于恒溫水浴振蕩器中，調節至適宜的溫度，反應一段時間后取出滅酶，冷卻后5000 r/min離心20 min，取出上層游離清油并稱重，按下式計算破乳率:

式中:m1為破乳后得到的清油質量(g)，m為稱取樣品的質量(g)，ω為油脂體的含油量(%)

1.2.5 破乳單因素實驗

1.2.5.1 酶解溫度對花生油脂體破乳率的影響 選取酶解溫度為40、45、50、55、60、65、70 ℃，料液比為1∶5 w/v，酶濃度為 1400 U/g，酶解時間為 3 h，按照1.2.4的實驗方法進行酶法破乳實驗，考察酶解溫度對破乳率的影響。

1.2.5.2 酶濃度對花生油脂體破乳率的影響 選取酶濃度為 400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800 U/g，酶解溫度為55 ℃，料液比為1∶5 w/v，酶解時間為3 h，按照1.2.4的實驗方法進行酶法破乳實驗，考察酶濃度對破乳率的影響。

1.2.5.3 酶解時間對花生油脂體破乳率的影響 選取酶解時間為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，酶解溫度為55 ℃，料液比1∶5 w/v，酶濃度為1400 U/g，按照1.2.4的實驗方法進行酶法破乳實驗，考察酶解時間對破乳率的影響;

1.2.5.4 料液比對花生油脂體破乳率的影響 選取料液比為 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 w/v，酶解溫度為55℃，酶濃度為1400 U/g，酶解時間為3 h，按照1.2.4的實驗方法進行酶法破乳實驗，考察料液比對破乳率的影響。

1.2.6 響應面優化試驗 在單因素實驗的基礎上，根據響應面設計原理［12］，選取酶解溫度(A)、酶濃度(B)、酶解時間(C)三個影響因素。設計三因素三水平響應面優化實驗，進一步優化確定木瓜蛋白酶破乳的最佳條件，響應面設計因素水平見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3 數據處理

實驗數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示。采用 Microsoft Office Excel 2013、SPSS 22.0、Design－Expert V8.0.6數據分析工具進行處理，并用Duncan多重比較法檢驗各處理之間的差異顯著性，p＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 花生及油脂體的主要成分

由表2可知，在花生種子中油脂及蛋白質的含量分別達到了51.55%和26.70%，因此花生不僅是優質的植物油料資源也是優質的植物蛋白資源。而經過復合植物水解酶初步提取后得到的花生油脂體中脂肪含量高達76.44%，而大量優質未被蛋白酶酶解的花生蛋白已被分離出去，因此油脂體中的蛋白質含量僅為2.25%左右，但有研究表明油脂體蛋白是影響油脂體穩定性的關鍵因素，蛋白質作為界面活性物質吸附或鑲嵌在油脂體表面，其龐大的分子結構在界面展開使內部疏水氨基酸暴露［13－14］，由于共價交聯及非共價相互作用形成一層具有一定強度及帶電性的蛋白膜，維持了油脂體三維結構的穩定性［15］。因此，利用蛋白酶作用破壞膜蛋白的結構，進而促進油脂體的聚集融合能達到較好的破乳效果［9］。

2.2 預處理對花生油脂體穩定性影響

2.2.1 粉碎時間對花生油脂體穩定性的影響 花生油脂體的粒徑大小是衡量花生油脂體穩定性的一個重要指標，花生油脂體的粒徑越大，說明花生油脂體越容易發生聚集融合，花生油脂體越不穩定，相反則說明花生油脂體越穩定［16－17］。由圖2 可知，花生粉碎時間對復合植物水解酶提取的花生油脂體粒徑大小有顯著影響(p＜0.05);在選定的粉碎時間內，隨著粉碎時間的增加，花生油脂體的粒徑表現出先增加后降低的趨勢，并且可以清楚的看到，在粉碎時間為10 s時，花生油脂體的中位粒徑與體積平均粒徑最大，說明在此條件下所得到的花生油脂體更加不穩定，有利于后期的破乳。朱凱艷等［18］的研究也發現花生的粉碎程度對水酶法乳狀液的穩定性有很大影響，適度粉碎可以降低工藝中產生的乳狀液穩定性，但當原料粒徑降低到最低值后繼續粉碎，會導致水酶法乳狀液穩定性增加。

圖2 粉碎時間對花生油脂體的粒徑的影響Fig.2 Effects of grinding time on the particle size of the peanut oil body

2.2.2 烘烤溫度對花生油脂體穩定性的影響 由圖3可知，隨著烘烤溫度的增加，復合植物水解酶提取得到的花生油脂體的中位粒徑和體積平均粒徑都顯著增加(p＜0.05)，這可能是因為隨著烘烤溫度的增加，花生中的水分減少，花生質地變脆，在粉碎時花生子葉細胞更易破碎，使花生油脂體聚集融合，最終導致花生油脂體的粒徑變大。

圖3 烘烤溫度對花生油脂體的粒徑的影響Fig.3 Effects of baking temperature on the particle size of the peanut oil body

通過圖4油脂體的粒徑分布可以看到，在較低的烘烤溫度下，花生油脂體的粒徑分布呈現出雙峰狀態，但隨著溫度的增加小于中位粒徑的油脂體數量逐漸減少，最終花生油脂體的粒徑不斷增加，而且其分布狀態也由雙峰狀態逐漸變為單峰狀態。

圖4 不同烘烤溫度所得花生油脂體的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of peanut oil body obtained at different baking temperature

結合顯微鏡照片(圖5)發現，隨著烘烤溫度的增加，花生油脂體的體積增大，更容易發生聚合，說明花生原料經過高溫烘烤后可以促進花生油脂體的聚合，有利于油脂的提取。

表2 花生和花生油脂體的主要成分Table 2 Proximate analysis of peanut andpeanutoilbody

圖5 不同烘烤溫度所得花生油脂體的顯微照片(400×)Fig.5 Micrograph of peanut oil body obtained at different baking temperatures(400×)注:A、B、C、D分別為60、80、100、120℃烘烤后花生油脂體的顯微照片。

2.3 破乳單因素實驗

2.3.1 酶解溫度對花生油脂體破乳率的影響 酶解溫度對花生油脂體破乳率的影響規律如圖6所示，當酶解溫度由40℃上升到55℃時，隨著溫度的增加，花生油脂體的破乳率呈現出逐漸增加的趨勢，并且在溫度為55℃時達到最大值;這可能是由于隨著溫度的升高，酶解溫度不斷接近木瓜蛋白酶的最適反應溫度，使得木瓜蛋白酶的作用效果增強。但是當酶解溫度繼續增加時，花生油脂體的破乳率表現出逐漸降低的趨勢，這可能是由于在酶解溫度達到木瓜蛋白酶的最適溫度后繼續增加酶解溫度，反而使得木瓜蛋白酶的酶活因過高的溫度而受到抑制，導致破乳率下降［19－20］。因此將后續響應面優化實驗的酶解溫度范圍確定為50～60℃之間。

圖6 酶解溫度對花生油脂體破乳率的影響Fig.6 Effect of enzymolysis temperature on the demulsification rate of peanut oil body

2.3.2 酶濃度對花生油脂體破乳率的影響 酶濃度對花生油脂體破乳率的影響規律如圖7所示，隨著酶濃度的不斷增加花生油脂體的破乳率呈現出先增加后逐漸平穩的趨勢，并且在酶濃度為1400 U/g的時候破乳率達到最大值。由酶促反應的特性可知，在酶濃度較低的時候，酶制劑的數量相對于底物的數量較少，此時酶的數量是限制酶促反應素的主要限制因素，因此增加木瓜蛋白酶的濃度，花生油脂體的破乳率表現出增加的趨勢;但是隨著酶濃度的逐漸增加，酶促反應的速度達到最大值，由于酶促反應受“底物飽和效應”的影響，破乳率呈現出逐漸平穩的趨勢［21］。因此綜合考慮破乳率和經濟因素的影響，選取酶濃度為1200～1600 U/g作為后續響應面優化實驗范圍。

圖7 酶濃度對花生油脂體破乳率的影響Fig.7 Effect of enzyme concentration on the demulsification rate of peanut oil body

2.3.3 酶解時間對花生油脂體破乳率的影響 酶解時間對花生油脂體破乳率的影響規律如圖8所示，在酶解時間由1 h逐漸增加到4 h的過程中，花生油脂體的破乳率呈現出逐漸增加的趨勢，并且在酶解時間為3 h時破乳率達到最大值，此后繼續增加酶解時間，破乳率不再繼續增加。這可能是由于在一定的酶濃度下，隨著酶解時間的增加，蛋白質被不斷的降解，在3.0 h左右的時候油脂體蛋白幾乎被完全降解，此后繼續酶解破乳率不再繼續增加。因此綜合考慮破乳率和生產經濟成本選擇2.5～3.5 h的時間范圍進行后面的響應面優化實驗。

圖8 酶解時間對花生油脂體破乳率的影響Fig.8 Effect of different enzymolysis time on the demulsification rate of peanut oil body

2.3.4 料液比對花生油脂體破乳率的影響 料液比對花生油脂體破乳率的影響規律如圖9所示，在選定的料液比范圍內料液比對破乳率的影響呈現出先增加后降低的趨勢，在料液比為1∶3時油脂體的破乳率最高達到了92.39%。而后繼續增加料液比，破乳率呈現出顯著的降低的趨勢(p＜0.05)。這可能是因為在相同的酶濃度下，較低的料液比實際上使破乳體系中單位體積內的酶濃度變的相對較高，而此時適當增加料液比，可以增大木瓜蛋白酶與油脂體蛋白的接觸機率，因此提高了酶解速度進而使破乳率增加。但是當料液比過大時，破乳體系中單位體積的酶濃度被稀釋，減少了木瓜蛋白酶分子與底物分子的碰撞幾率，酶解速率下降導致破乳率降低［22］。因此選擇料液比為1∶3進行后續實驗。

圖9 料液比對花生油脂體破乳率的影響Fig.9 Effect of material－to－liquid ratioon the demulsification rate of peanut oil body

2.4 響應面優化試驗

2.4.1 響應面試驗設計結果 由Design－Expert 8.0.6統計分析軟件的實驗設計功能可知，以花生油脂體的破乳率為響應值(Y)，以酶解溫度(A)、酶濃度(B)、酶解時間(C)為自變量，建立三因素三水平的Box－Behnken設計包括17個實驗方案，具體的實驗方案及實驗結果如表3所示。利用Design Expert 8.0.6軟件對實驗結果進行回歸擬合分析，得到酶解溫度(A)、酶濃度(B)、酶解時間(C)三個因素對花生油脂體破乳率的二次回歸方程為:Y=91.76+1.63A+4.89B+1.33C－0.51AB+0.34AC+0.21BC－14.47A2+1.54B2－9.72C2。

表3 響應面實驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface analysis

對響應面分析中得到的花生油脂體破乳率Y的二次模型方程進行方差分析，結果如表4所示，由方差分析的結果可知回歸方程模型檢驗極顯著(p＜0.01)，而失擬項檢驗不顯著(p＞0.05)，且得到的回歸模型的R2=0.9944，R2adj=0.9872，說明回歸模型擬合程度較好，具有一定的可靠性，可以用來預測花生油脂體破乳工藝的結果。花生油脂體破乳率響應面方程的一次項:酶解溫度(A)、酶濃度(B)、酶解時間(C)和其分別對應的二次項:A2、B2、C2均顯著(p＜0.05)，根據平方和判斷各因素影響順序依次為:酶濃度＞酶解溫度＞酶解時間。

表4 回歸模型及方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

各因素的交互作用對破乳率的影響如圖10所示。通過觀察響應面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映溫度(A)、酶濃度(B)、酶解時間(C)之間的交互作用對花生油脂體破乳率的影響，當等高線呈圓形時表示兩因素交互作用對破乳率的影響不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著［23］。由圖10可知，酶濃度(B)和酶解時間(C)、酶濃度(B)和溫度(A)的等高線呈現出馬鞍狀，且酶濃度(B)和溫度(A)的等高線較為密集，說明它們之間均存在交互作用，且酶濃度(B)和溫度(A)之間的交互作用對破乳率的影響較大，但響應面坡度較為平緩，說明參數范圍選擇較小。而溫度(A)和酶解時間(C)的等高線為圓形且在選定范圍內有極值出現，說明溫度(A)和酶解時間(C)交互作用對破乳率的影響不顯著與表4的方差分析相符合。

圖10 兩因素交互作用對破乳率影響的響應面圖Fig.10 Response surface of two factors interaction effects on the demulsification rate

2.4.2 最佳破乳工藝的確定及驗證 通過Design－Expert軟件分析，得到木瓜蛋白酶對花生油脂體破乳的最佳工藝參數為:酶解溫度58.26℃，酶濃度為1400.00 U/g，酶解時間為3.03 h，預測花生油脂體的破乳率為93.09%?？紤]到實際條件，調整為酶解溫度58℃，酶濃度為1400 U/g，酶解時間為3 h。在此條件下進行三組平行實驗進行驗證，得到的平均破乳率為93.44% ±0.82%，相對誤差為0.38%，預測值與實際值吻合較好。

3 結論

本研究對傳統水酶法工藝進行改進，采用復合植物水解酶提取花生油脂體，并進一步研究花生烘烤溫度及粉碎時間對花生油脂體穩定性的影響，結果發現，在粉碎時間為10 s時所得到的花生油脂體的粒徑最大，粉碎時間繼續增加油脂體的粒徑反而減小;此外在60～160℃溫度范圍內，油脂體粒徑隨著烘烤溫度的增加而不斷增加，且粒徑分布由雙峰逐漸過渡為單峰狀態。此外根據響應面優化試驗得到木瓜蛋白酶破乳的最佳條件為:酶解溫度58℃，酶濃度1400 U/g，酶解時間3 h，料液比1∶3(w/v)，在此條件下預測花生油脂體的破乳率為93.09%。選擇最佳實驗條件進行三組平行實驗驗證，得到平均破乳率為93.44% ±0.82%，相對誤差為0.38%，預測值與實際值吻合較好。