1- MCP結合哈茨木霉菌對櫻桃番茄貯藏的保鮮效果

曹 森，吉 寧，馬 超，巴良杰，張兵兵，馬立志，鐘 梅，王 瑞，*

(1.貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州貴陽550005;2.貴州省果品加工工程技術研究中心，貴州貴陽550005;3.貴州向黔沖食品有限公司，貴州清鎮551400)

櫻桃番茄(Lycopersivonesculentum Mill.)又名珍珠果、小西紅柿、圣女果，是一種呼吸躍變型果實，被聯合國糧農組織列為優先推廣的四大水果之一［1］。櫻桃番茄色澤艷麗，形態誘人，酸甜可口，富含多種維生素和礦質元素以及多種對人體有益的氨基酸，深受消費者的喜愛［2］。但由于番茄屬于皮薄汁多的漿果，采后生理代謝比較旺盛，并且果實易受到機械損傷以及微生物侵染，貯藏期間容易腐爛變質［3－4］，這極大地限制了果實的銷售期和銷售半徑。近年來，隨著櫻桃番茄種植面積和鮮果產量的逐年增加，生產上亟需適宜的櫻桃番茄保鮮理論和技術。因此，尋找合適的櫻桃番茄保鮮理論和貯藏技術是番茄產業健康可持續發展面臨的重要問題。

1－甲基環丙烯(1－methylcyclopropene，1－MCP)作為一種乙烯抑制劑，能夠抑制乙烯與受體的結合和信號傳導，減緩果蔬組織對乙烯的敏感性，從而延緩果蔬的成熟與衰老［5－6］。1－MCP 具有使用劑量低和安全、高效等優點，被廣泛應用于獼猴桃［7］、香蕉［8］、葡萄［9］等采后貯藏保鮮，但高濃度的 1－MCP 會影響部分果實的口感，并且乙烯的合成會影響一些與病害相關的蛋白的產生、細胞膜的通透性，影響活化酚類物質代謝以及活性氧的積累［10］。

木霉菌(Trichoderma)是一種對多種植物病原菌都有很強的拮抗作用的生防菌，由于木霉菌生長繁殖速度快，能夠迅速占領營養空間、產生抗菌素，并具有廣泛適應性、廣譜性、多機制性及無毒等多種特點，所以它是一種應用潛力巨大的生防菌［11］。目前，木霉菌在果實貯藏保鮮中相關報道較少，采前噴施3.0×106CFU/mL的哈茨木霉菌能夠有效地保持藍莓貯藏期的貯藏品質和生物活性［11］。但關于1－MCP結合木霉菌處理的研究還未見過相關報道。因此，本研究選取純微生物殺菌劑的哈茨木霉菌作為櫻桃番茄的保鮮劑，研究采前噴施哈茨木霉菌結合采后1－MCP熏蒸對果實貯藏品質的影響，旨在延長櫻桃番茄的貯藏期，為可規模化的櫻桃番茄保鮮提供更為有效、安全、快捷的保鮮方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

榮耀F1代櫻桃番茄 采自貴州向黔沖綜合農業有限公司基地，法國最新育成黃色串收櫻桃番茄品種，抗病性強，無限生長型;1－MCP(≥99%) 美國陶氏益農公司;哈茨木霉菌(葉部型 3×108CFU/g) 美國拜沃股份有限公司;厚度0.03 mm PE保鮮膜 國家農產品保鮮工程技術研究中心。

精準控溫保鮮庫(±0.5℃、90±5%) 國家農產品保鮮工程技術研究中心;TA.XT.Plus質構儀 英國SMS公司;TGL－16A臺式高速冷凍離心機 長沙平凡儀器儀表有限公司;UV－2550紫外分光光度計 日本Shimazhu公司;pHS－25型數顯酸度計 上海虹益儀器儀表有限公司;PAL－1型迷你數顯折射計 日本ATAGO;PBI Dansensor殘氧儀 丹麥丹圣公司;GC－14氣相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 果實采收與處理 2017年8月20日9:00～11:00在貴州向黔沖綜合農業有限公司基地，選擇八到九成熟(櫻桃番茄剛完全轉黃色)的榮耀F1代櫻桃番茄做好標記，用蒸餾水配置濃度為3.0×106CFU/mL哈茨木霉菌，通過手持噴霧器均勻噴布在果實表面，以櫻桃番茄表面均著藥液、開始滴液即可，對照處理(CK)噴灑相同量的蒸餾水，3 d后對處理的果實進行采摘，并立刻運回貴州省果品加工工程技術研究中心果蔬貯藏與保鮮研究室。選擇大小及顏色基本一致、無病蟲害、無機械損傷的果實，分成四組，每組15 kg果實(每個處理3個平行，每個平行5 kg)，使用大功率工業風扇除去田間熱，并愈傷24 h。然后分別置于兩個低密度聚乙烯(厚度:0.08 mm，體積:1 m3)帳內;以0.5 μL/L的1－MCP分別對其中2組樣品進行熏蒸處理24 h(25±2℃)，為保證賬內完全密封，熏蒸前將帳子搭好并僅留一處開口，立即將稱量好的1－MCP放入盛裝蒸餾水的燒杯里，然后立即使用封口膠將開口處密封，其他兩組只放相同質量的蒸餾水進行熏蒸，熏蒸后經30μm的PE保鮮膜分裝，分裝后將不同處理(采前噴水+蒸餾水熏蒸處理記為S1;采前噴3.0×106CFU/mL哈茨木霉菌+蒸餾水熏蒸記為 S2;采前噴水 +0.5μL/L的1－MCP處理記為 S3;3.0×106CFU/mL哈茨木霉菌+0.5μL/L的1－MCP處理記為S4)的番茄櫻桃放置在(11±0.5)℃的環境中預冷24 h后扎袋貯藏(貯藏溫度為(11±0.5)℃，RH≥85%)。每隔12 d隨機取樣對樣品各項指標進行測定，結果取平均值，測定周期為48 d。

1.2.2 腐爛率的測定 采用稱重法來測定櫻桃番茄的腐爛率，判斷標準以局部長霉、腐爛、流水等全部計入腐爛果實質量，計算公式如下:

1.2.3 硬度的測定 采用物性儀測定，測試硬度參數如下:將櫻桃番茄橫向放置在質構儀上，有果蒂一頭朝向質構儀左邊，采用P/2N探頭對其進行穿刺測試，穿刺深度為6 mm，測前速度2 mm/s，測中速度1 mm/s，測后速度2 mm/s，觸發力5.0 g，各處理重復測定15次，取其平均值，單位為g。

1.2.4 呼吸強度的測定 采用靜置法經殘氧儀測定［12］。稱取質量為(300±5)g番茄置于11.5℃密閉容器中3 h，然后測定氧氣和二氧化碳濃度。計算

式中:X 為呼吸強度，mg CO2·kg－1·h－1;N 為二氧化碳體積分數，%;V為容器體積(干燥器體積－果實體積)，L;m為樣品質量，kg;t為放置時間，h;1.894 g/L為常壓下二氧化碳的密度。

1.2.5 乙烯生成速率的測定 乙烯生成速率采用氣相色譜儀程序升溫法進行測定［13］。色譜柱條件:Agilent，DB－5(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);檢測器:FID，溫度 230℃;進樣口:溫度120℃;升溫程序:80℃保持2 min。6℃/min升溫至230℃，保持1 min。載氣:N2，流速 24 mL/min;尾吹氣:N2，流速30 mL/min，尾吹:30 mL/min。每次取(300±5)g番茄放入干燥器內，密封3 h，取樣10 mL進行測定。

1.2.6 可溶固形物含量的測定 每處理隨機取20個番茄果實，高速組織搗碎后10000 r/min離心10 min后，取上清液使用PAL－1迷你數顯折射儀測定。

1.2.7 可滴定酸含量的測定 參照GB/T 12456－2008測定。

1.2.8 VC含量的測定 參照鉬藍比色法測定［14］，略有改動。準確稱取10.0 g櫻桃番茄勻漿于容量瓶中，加入草酸－EDTA溶液并定容于100 mL容量瓶中，過濾。吸取10 mL濾液于50 mL容量瓶中，并加入1.0 mL的偏磷酸－醋酸溶液、5%的硫酸2.00 mL，搖勻后，加入4.0 mL鉬酸銨溶液，以蒸餾水定容至50 mL，其中以蒸餾水為空白對照，于705 nm處測定吸光度，并計算含量。計算公式為:公式為:

式中:C為測定用樣液中VC的含量(mg);V1樣液定容總體積(mL);V2測定用樣液體積(mL);W為樣品質量(g)。

1.2.9 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定 參考曹建康等［15］果蔬采后生理生化實驗指導書的方法進行測定(規定0.01 A/min=1U)。

1.2.10 過氧化物酶(POD)活性的測定 采用愈創木酚法，參照張群等［16］的測定方法，略有改動。稱取3 g櫻桃番茄果肉組織(－78℃冰箱內液氮粉碎的樣品)，加入15 mL 50 mmol/L p H為5.5的磷酸鈉緩沖液中，冰浴研磨，10000×g冷凍(4℃)離心15 min，取上清液用于 POD活性測定，取一支試管，加入3.0 mL 25 mmol/L的愈創木酚溶液和0.5 mL酶提取液，再加入0.5 mL質量分數1%的H2O2溶液迅速混合啟動反應，同時開始計時。將反應混合液倒入比色杯中，以蒸餾水為參比，在反應15 s時測其在波長460 nm處的吸光值，并每間隔30 s記錄1次，連續測定，至少獲得6個點的數據，重復3次(規定0.01 A/min=1U)。

1.2.11 多酚氧化酶(PPO)活性的測定 采用鄰苯二酚法，參照張群等［16］的測定方法，略有改動。取－70℃冰箱內液氮粉碎的樣品3 g，酶液提取方法同POD提取法。取1支試管，加入1.5 mL 50 mmol/L、pH5.5的乙酸－乙酸鈉緩沖液和1.0 mL 50 mmol/L鄰苯二酚溶液，后加入1 mL酶提取液，以緩沖液為參比，同時開始計時。在反應15 s時測其在波長398 nm處的吸光值，并每間隔30 s記錄1次，連續測定，至少獲得6個點的數據，重復3次(規定0.01 A/min=1 U)。

1.2.12 脂氧合酶(LOX)活性的測定 參照張群等［16］的測定方法，略有改動。取－70℃冰箱內液氮粉碎的的樣品3 g，加25 mL 100 mmol/L，p H8.0 Tris－HCl磷酸緩沖液，冰浴研磨，10000×g冷凍(4℃)離心15 min，取上清液用于LOX酶活的測定。反應液包括2.85 mL pH6.0的100 mmol/L磷酸鈉緩沖液、50μL 10 mmol/L亞油酸鈉和0.1 mL酶液，空白為2.95 mL pH6.0的100 mmol/L磷酸鈉緩沖液和50μL 10 mmol/L亞油酸鈉，30℃反應，在234 nm下測定吸光度(規定0.01 A/min=1 U)。

1.3 數據處理與分析

采用OriginPro 8.0軟件對數據進行統計處理，采用SPSS 19.0軟件的Duncan氏新復極差法進行數據差異顯著性分析(p＜0.05為差異顯著)。

2 結果與分析

2.1 不同處理對櫻桃番茄腐爛率和硬度的影響

腐爛率是櫻桃番茄貯藏效果的直接體現，硬度是反映果實軟化程度的重要外在指標。由圖1(A)可知，櫻桃番茄在貯藏12 d內的腐爛率沒有顯著差異(p＞0.05)，從貯藏12 d開始，S1組的腐爛率開始快速上升，而其他處理緩慢上升，貯藏24 d時，各個處理腐爛率的大小關系為S1組＞S3組＞S2組＞S4組。從貯藏24 d開始，S2組腐爛率開始快速上升至貯藏末期(48 d)，在貯藏48 d時，S1組、S2組、S3組、S4組的腐爛率分別為49.85%、37.89%、28.56%和19.81%，并且各個處理間均有顯著差異(p＜0.05)，說明S4組能夠更好地抑制果實腐爛率的上升，S3組次之。由圖1(B)可知，番茄的硬度在貯藏期間呈現先上升后下降的趨勢，不同處理的果實硬度均在貯藏12 d時達到峰值，從貯藏12 d開始，各個處理的硬度均呈現不同程度的下降。在貯藏末期(48 d)時，S4組顯著高于其他處理(p＜0.05)，而其他處理與對照沒有顯著性差異(p＞0.05)，可能由于哈茨木霉菌的菌絲可以纏繞并且能夠寄生疫霉菌或灰霉菌的菌絲使其斷裂，從而延緩腐爛［11］，而1－MCP抑制果實的呼吸作用，延緩果實采后衰老［4］，兩者結合效果最好，并且可以將果實貯藏期延長至48 d。因此，S4組能夠更好地延緩果實硬度的下降，而S2和S3對果實硬度下降的抑制沒有S4組效果好。

圖1 不同處理對櫻桃番茄腐爛率(A)和硬度(B)的影響Fig.1 Effects of different treatments on the rot ratio(A)and the firmness(B)of cherry tomato

2.2 不同處理對櫻桃番茄呼吸強度和乙烯生成速率的影響

呼吸強度和乙烯生成速率是果實貯藏期間生理變化主要指標。由圖2可知，果實的呼吸強度和乙烯生成速率在貯藏期間呈現先上升后下降的趨勢，這與番茄果實屬于呼吸躍變型果實結論一致［17］。由圖2(A)可知，不同處理的呼吸強度在貯藏初期差異不顯著(p＞0.05)，S1、S2組處理的呼吸強度在貯藏12 d時達到峰值，而S3、S4處理的呼吸強度在貯藏24 d達到峰值，說明S3、S4組處理能夠推遲櫻桃番茄呼吸峰的出現，在貯藏末期(48 d)，不同處理的櫻桃番茄呼吸強度大小關系為S1組＞S2組＞S3組＞S4組，并且S4組與其他處理組比較均有顯著差異(p＜0.05)。由圖2(B)可知，S1組和S2組處理的乙烯生成速率在貯藏12 d時達到峰值，S3、S4組處理的乙烯生成速率在貯藏24 d達到峰值，這與圖2(A)果實呼吸強度的結果一致，說明S3、S4組均能夠推遲呼吸峰的出現，說明1－MCP處理能夠推遲果實呼吸峰的出現。在貯藏48 d時，S4組的乙烯生成速率顯著(p＜0.05)低于其他處理，而S3組與其他組沒有顯著性差異(p＜0.05)，原因可能是S3組在貯藏48 d時，由于致病菌侵染導致果實快速腐爛，從而加快呼吸和乙烯的上升，說明S4組能夠保持果實較低的呼吸強度和乙烯生成速率。

圖2 不同處理對櫻桃番茄呼吸強度(A)和乙烯生成速率(B)的影響Fig.2 Effects of different treatments on the respiration rate(A)and the ethylene production rate(B)of cherry tomato

2.3 不同處理對櫻桃番茄可溶性固形物和可滴定酸含量的影響

可溶性固形物與可滴定酸含量是果實口感的直接體現。由圖3可知，櫻桃番茄的可溶性固形物和可滴定酸含量均呈現先上升后下降的趨勢，并且均在貯藏12 d時出現峰值。由圖3(A)可知，在貯藏12 d時，S4組顯著(p＜0.05)高于 S1、S2組，但與S3組沒有顯著性差異(p＞0.05)，在貯藏末期(48 d)時，S1、S2、S3、S4組的可溶性固形物含量分別為4.56%、4.87%、5.19%和5.45%，并且S2、S3、S4組與S1組有顯著性差異(p＜0.05)，而S4組與S2、S3處理沒有顯著性差異(p＞0.05)。由圖3(B)可知，在貯藏12 d時，各個處理的可滴定酸含量均沒有顯著性差異(p＞0.05)，從貯藏12 d開始，不同處理的可滴定酸含量均呈現不同程度的下降，在貯藏48 d時，不同處理的可滴定酸大小關系為S4組＞S2組＞S3組＞S1組。說明哈茨木霉菌處理在抑制果實可滴定酸下降的效果優于1－MCP處理。因此，與對照組比較(S1)，不同處理均能夠延緩可溶性固形物和可滴定酸含量的下降，其中S4處理組的效果最好。

圖3 不同處理對櫻桃番茄可溶性固形物(A)和可滴定酸含量(B)的影響Fig.3 Effects of different treatments on the soluble solids content(A)and the titratable acid content(B)of cherry tomato

2.4 不同處理對櫻桃番茄VC含量和SOD活性的影響

VC含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性是衡量果實營養價值和衰老程度的重要指標，SOD能通過歧化反應清除生物細胞中的超氧陰離子自由基，從而降低自由基對有機體的毒害作用，其采后的活性對果實的品質影響較大［18］。由圖4(A)可知，VC含量在貯藏期間呈現先上升后下降的趨勢，在貯藏12 d時達到峰值，此時不同處理的大小關系為S4＞S3＞S2＞S1，在貯藏48 d時，S4組的 VC含量顯著(p＜0.05)高于對照組(S1)，但與其他處理沒有顯著差異(p＞0.05)。由圖4(B)可知，櫻桃番茄的SOD活性從貯藏開始到貯藏12 d呈現上升的趨勢，此時各個處理組之間沒有顯著差異(p＞0.05)，從貯藏12 d開始，S1、S2組和S3組的SOD活性開始快速下降，而S4組的 SOD活性則相對緩慢下降，在貯藏末期(48 d)，S4組的VC含量顯著(p＜0.05)高于對照組(S1)，但與其他處理沒有顯著差異(p＞0.05)。由此說明，不同處理之間均能夠抑制櫻桃番茄VC含量和SOD活性的下降，但S2、S3組、S4組相互之間均沒有顯著性差異(p＞0.05)，說明哈茨木霉菌和1－MCP在維持果實VC含量和SOD活性效果沒有明顯區別，綜合比較，S4組維持果實VC含量和SOD活性的效果最好，S3組次之。

圖4 不同的處理對櫻桃番茄維生素C含量(A)和SOD活性(B)的影響Fig.4 Effects of different treatments on the vitamin Ccontent(A)and the superoxide dismutase activity(B)of cherry tomato

2.5 不同處理對櫻桃番茄PPO、POD和LOX活性的影響

果實的貯藏效果與相關酶的活性密不可分，酶的活性反映櫻桃番茄的貯藏品質。多酚氧化酶(PPO)是能夠催化簡單酚類的一種含有銅為輔基的氧化酶，當果蔬組織受到病菌侵染或者其他逆境脅迫的時候，PPO活性會快速升高，從而保護植物組織［19］。由圖5(A)可知，從貯藏開始到貯藏12 d時，不同處理的PPO活性均呈現上升趨勢，原因可能由于剛入庫的櫻桃番茄受低溫脅迫導致的，或由于櫻桃番茄采收后進行愈傷導致的。從貯藏12 d開始，不同處理的PPO活性開始下降，在貯藏結束時，S4組均顯著(p＜0.05)低于其他處理。

過氧化物酶(POD)能夠將SOD作用產物過氧化氫催化分解成對體內細胞沒有傷害的氧氣與水，使體內不受過氧化氫傷害，所以POD的活性是衡量系統清除自由基能力的重要指標［20］。由圖5(B)可知，不同處理櫻桃番茄的POD活性呈現先上升后下降的趨勢，在貯藏12 d時，不同處理櫻桃番茄的POD活性大小關系為S2組 ＞S4組 ＞S3組 ＞S1組，并且S2、S4組與其他處理有顯著差異(p＜0.05)，而S2組和S4組沒有顯著差異(p＞0.05)，在貯藏48 d時，S4組顯著(p＜0.05)高于其他處理，但其他處理間沒有顯著差異(p＞0.05)。

圖5 不同的處理對櫻桃番茄PPO(A)、POD(B)和LOX活性(C)的影響Fig.5 Effects of different treatments on the polyphenol oxidase activity(A)，the peroxidase activity(B)and the lipoxygenase activity(C)of cherry tomato

脂氧合酶(LOX)是直接或間接的參與組織衰老的一種含有非血紅素鐵的蛋白質，它可以通過與多聚不飽和脂肪酸發生氧化，使細胞膜的完整性受損并且改變膜的通透性，在膜脂氧化過程中起到關鍵的作用，也是衡量果蔬衰老的關鍵指標［19］。由圖5(C)可知，LOX活性在貯藏期間呈現上升的趨勢，在貯藏前期，不同處理的LOX活性沒有顯著差異(p＞0.05)，在貯藏末期(48 d)時，不同處理的LOX活性大小關系為S1組＞S2組＞S3組＞S4組，并且各個處理間均有顯著差異(p＜0.05)。由此可知，不同的處理均能夠保持櫻桃番茄的酶活性，其中S4組處理效果最好，能夠更好地抑制櫻桃番茄PPO活性和LOX活性的上升，延緩POD活性的下降。

3 討論

番茄灰霉病是由半知菌亞門真菌，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的一種世界性重要病害，發病后傳播迅速［21］，因此，灰霉病的發生率是番茄果實貯藏效果重要因素之一，而木霉菌的菌絲可以纏繞并且能夠寄生疫霉菌或灰霉菌的菌絲使其斷裂［22］，從而抑制果實的腐爛。本研究結果表明，不同處理均能夠延緩果實腐爛率的上升和抑制果實硬度的下降，其中，在貯藏前期，S2組處理(哈茨木霉菌)的腐爛率低于S3組(1－MCP)處理，而貯藏后期S2處理的腐爛率高于S3，說明哈茨木霉菌在貯藏前期對櫻桃番茄的腐爛率抑制效果優于1－MCP處理，而1－MCP處理在貯藏后期對果實腐爛率的抑制效果更好，但通過比較發現，S4組(哈茨木霉菌結合1－MCP)在整個貯藏期間能夠更好地延緩櫻桃番茄腐爛率的上升。

1－MCP作為一種乙烯受體抑制劑，能不可逆地作用于乙烯受體，阻斷乙烯的正常結合，抑制所誘導的與果蔬或衰老相關的一些列生理生化反應。Tassoni等［23］研究表明，1－MCP 能夠抑制番茄乙烯受體基因的表達，從而延緩番茄的衰老。Beno等［24］研究表明，1μL/L的1－MCP能夠抑制貯藏期間番茄的軟化。鄭鐵松等［25］研究表明，1－MCP明顯減緩了番茄硬度的下降，抑制了呼吸強度的增大，并有利于保持番茄果肉細胞結構的完整性，最好的保鮮濃度在0.5～0.9μL/L之間。本實驗研究表明，S3處理能夠抑制果實的呼吸強度和乙烯生成速率，這與前人結果研究一致。但有研究表明，高濃度的1－MCP影響貯藏期間果實的口感和香氣［26－27］，所以，本實驗為更好地保持櫻桃番茄貯藏的品質和口感，確認哈茨木霉菌結合1－MCP對櫻桃番茄保鮮的有效性。結果表明，S4組(哈茨木霉菌結合1－MCP)能夠更好地抑制果實硬度的下降，降低果實的呼吸強度和乙烯生成速率，維持果實可溶性固形物、可滴定酸含量、VC含量和SOD活性。另外，本實驗還研究了不同處理對櫻桃番茄生理相關酶的影響，結果表明S4(哈茨木霉菌結合1－MCP)處理可以抑制PPO、LOX的活性升高，延緩POD活性的降低，進而延緩果實的衰老，保持貯藏期間櫻桃良好的貯藏品質。

4 結論

本實驗研究表明，與對照(S1)相比，不同的處理均能夠抑制腐爛率上升，延緩果實硬度、可溶性固形物、可滴定酸含量和VC含量的下降，降低果實的呼吸強度和乙烯生成速率，更好地保持 SOD、PPO、POD、LOX 活性，其中 S1、S2、S3、S4 的腐爛率在貯藏末期(48 d)分別為 49.85%、37.89%、28.56%和19.81%。通過比較，采前噴施3.0×106CFU/mL哈茨木霉菌結合采后用0.5μL/L的1－MCP來處理櫻桃番茄對果實的貯藏效果最好，能夠明顯延緩果實的衰老進程，保持較高的貯藏品質，并且櫻桃番茄在貯藏末期(48 d)時腐爛率最低。