魔芋低聚糖對高脂飲食小鼠脂代謝的影響

周中凱，趙亞麗,2，楊星月,2

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，天津 300041）

魔芋中存在大量的多糖，結構顯示為魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）[1]。KGM具有良好的吸水性、成膜性、增稠性、可塑性、乳化性、結構性、保水性和賦形性等多種性質[2-3]，其獨特的流變和凝膠性使它在功能性食品等領域被廣泛應用[4-5]。另外營養學研究表明，KGM具有良好的減肥、降脂和潤腸通便作用[6-9]。但由于KGM相對分子質量較高、黏度大，因此在食品工業上的應用受到限制。因此，將魔芋中的大分子降解為中小分子，如魔芋低聚糖（konjac oligosaccharides，KOS）產品[10]，不僅可以大大降低其黏度，還可以極大程度提高其在食品中的應用范圍，特別是生成的低聚糖類產品也是活性較強、生理功能顯著的一類產品。因此本研究以低聚糖為干預原料來證實其功效。

關于魔芋低聚糖的功效已經有了一些研究：楊艷燕等[11]研究了魔芋二糖或三糖異構體的低聚糖對小鼠血糖能力和抗氧化能力的影響；譚揚等[12]研究了魔芋低聚糖的通便功能；陳黎等[13]研究魔芋低聚糖的降脂作用。控制KGM非徹底降解可獲得不同聚合度的魔芋葡甘低聚糖[14]，不同分子質量的魔芋低聚糖其功效也有所不同。本實驗用解淀粉芽孢桿菌發酵制得的酶液水解鮮魔芋，得到魔芋低聚糖水溶液，將其離心、噴霧后制得魔芋低聚糖粉末，將其加入高脂飼料以研究其功效。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性健康昆明小鼠，體質量（22±2）g，由中國人民解放軍軍事醫學院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK-（軍）2012-0004。

白魔芋購于陜西省安康市嵐皋縣。小鼠基礎飼料購于中國人民解放軍軍事醫學院實驗動物中心，高脂飼料配方：63.8%（質量分數，下同）基礎飼料、15%豬油、10%蔗糖、1%膽固醇、0.2%膽酸鈉、10%蛋黃粉。干預飼料配方：60.8%基礎飼料、3%魔芋低聚糖、15%豬油、10%蔗糖、1%膽固醇、0.2%膽酸鈉、10%蛋黃粉。

總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物科技有限公司；動物組織總RNA提取試劑盒北京天根生化科技有限公司；反轉錄（r e v e r s e transcription，RT）及RT-聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 美國Thermo公司；引物由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table1 Primer sequences used for RT-PCR

1.2 儀器與設備

Step one plus定量PCR儀 美國ABI公司；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS） 美國布魯克道爾頓公司；MK-3酶標儀 美國Thermo公司；智能培養箱 寧波賽福實驗儀器有限公司；XMTD-204數顯式電熱恒溫水浴鍋天津市歐諾儀器表有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魔芋低聚糖的制備

魔芋洗凈、去皮、切片，稱質量后用打漿機打漿制成漿液（魔芋和蒸餾水的料液比為1∶10，打漿時間30 s），將漿液裝入錐形瓶中加酶（酶活力2 509 U/mL，酶與漿液的體積比1∶100），該酶為解淀粉芽孢桿菌發酵制得），將漿液放在磁力攪拌器上攪拌30～40 min直至均勻，在45 ℃條件下放入水浴搖床180 r/min振蕩4 h后，4 000 r/min離心20 min，取上清液，將上清液放入高壓滅菌鍋滅酶（121 ℃，20 min），取出冷卻至室溫后過3層粗棉布除去沉淀的纖維類物質，收集濾液噴霧干燥（進風溫度180 ℃，出風溫度80～90 ℃）制得粉末，收集置于干燥器中備用。魔芋低聚糖粉末外觀呈粉狀，白色，無臭無味。KOS經過酶解、分離、精制等工序，基本脫去非多糖成分，魔芋低聚糖純度在90%以上，其他為少量單糖，基本無其他成分（如蛋白質等成分）的檢出；經MALDI-TOF-MS檢測出魔芋低聚糖m/z為744。

1.3.2 動物實驗

飼養條件：溫度（2 0～2 5）℃，相對濕度50%～55%，正常采光，動物實驗符合國家《實驗動物管理條例》。

隨機將小鼠分為3 組：正常飼料組（NC）、高脂飲食組（MC）、低聚糖干預高脂飲食組（KOS），每組12 只。第1周：適應性喂養，各組小鼠均進食正常飼料；第2～5周：NC組進食正常飼料，KOS組、MC組均進食高脂飼料；第6～9周：NC組進食正常飼料，KOS組進食干預飼料，MC組進食高脂飼料。所有小鼠均自由進食、飲水。

1.3.3 指標檢測

1.3.3.1 血清樣本的采集

實驗結束后，將小鼠禁食12 h后，眼球取血，血樣于室溫靜置2 h，5 000 r/min離心10 min后，取上層血清置于－80 ℃貯存備用。

1.3.3.2 肝指數、體脂比的測定

小鼠處死后立即解剖，取出肝臟、脂肪，用濾紙吸干表面水分后稱其濕質量，分別根據式（1）、（2）計算肝指數和體脂比。

1.3.3.3 血清指標的測定

TC、TG、LDL-C、HDL-C、T-AOC、T-SOD、GSH-Px、MDA水平嚴格按照試劑盒的相關說明測定，每個樣品重復測3 次，取平均值。

1.3.4 小鼠肝臟中脂代謝相關基因mRNA轉錄水平的測定

小鼠總RNA提取采用動物組織總RNA提取試劑盒，用DNA酶去除基因組DNA。用Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒合成單鏈cDNA，反應條件為37℃反應15 min，85 ℃反應5 s并于4 ℃條件下儲存。聚合酶鏈式反應采用Step one plus定量PCR儀進行，20 μL反應體系包含0.4 μmol/L前引物和后引物、1 μg cDNA、10 μL SYBR Ⅱ熒光染料和0.4 μL ROX參比熒光染料。熱循環條件為95 ℃預變性30 s，之后95 ℃反應5 s，60 ℃反應34 s，交替進行40 個循環，每個循環結束儀器測定記錄熒光強度。β-actin基因作為內參基因，mRNA相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 膳食對小鼠體質量的影響

各組小鼠1～9 周體質量如圖1所示，其中6～9 周為干預時間。本實驗采用兩段式喂養方式：2～5周建模期，以高脂飼料喂養小鼠（MC組小鼠和KOS組小鼠）以得到肥胖小鼠，2～5 周高脂飲食的小鼠體質量并無顯著差異。第6周開始用KOS對高脂小鼠進行干預。第6～9周，MC組小鼠體質量明顯高于NC組小鼠，這說明高脂飲食可以誘導小鼠體質量增加。而進行KOS干預（6～9周）后，KOS組小鼠體質量趨于平穩，隨著時間的延長，KOS組小鼠的體質量與MC組小鼠體質量差異愈來愈大。這說明低聚糖干預對高脂飲食小鼠體質量的增加有抑制作用。

圖1 各組小鼠第1～9周體質量變化Fig.1 Body mass changes of mice during the experiment

2.2 膳食對小鼠肝指數和體脂比的影響

表2 各組小鼠肝指數、體脂比和血糖水平Table2 Liver index, fat to body mass ratio and blood glucose in each group

肝指數是動物的一項重要生理指標。當肝臟出現補償增生時，表明肝臟的解毒負擔也相應增加[15]。由表2可知，KOS組小鼠的肝指數顯著低于MC組小鼠，且接近于NC組小鼠，說明魔芋低聚糖可以抑制高脂飲食小鼠肝臟的增大，有利于預防脂肪肝等疾病的發生。腎周脂肪和附睪脂肪，占動物機體脂肪總含量的一定比例，所以通常利用腎周脂肪和附睪脂肪占體質量的百分比（體脂比）來反映小鼠的肥胖狀況。

實驗結束后，各組小鼠體脂比由高到低依次為：MC組、KOS組、NC組。MC組的小鼠體脂比顯著高于NC組小鼠（P＜0.05），這說明長期的高脂飲食會造成機體內脂肪的過多累積。而低聚糖干預后，KOS組小鼠的體脂比顯著低于MC組，這說明低聚糖干預有效降低了小鼠體內脂肪的積累。

在正常情況下，機體具有維持一定血糖水平的能力，以維持正常的糖脂代謝。高脂飼料會導致小鼠血糖水平升高，如果血糖水平持續升高會導致許多健康問題，比如糖尿病、心血管疾病等。在本實驗中，KOS組小鼠血糖水平低于MC組，但兩者并無顯著性差異。

2.3 膳食對小鼠血脂水平的影響

表3 各組小鼠血脂水平Table3 Blood lipid levels in each group mmol/L

由表3可知，與NC組相比，MC組小鼠TC、TG、LDL-C濃度顯著增加（P＜0.05），HDL-C濃度顯著降低，說明高脂飲食會導致小鼠脂代謝紊亂。與MC組相比，KOS組小鼠的TC、TG、LDL-C濃度顯著降低，HDL-C濃度顯著提高，說明低聚糖干預對高脂飲食的小鼠有降低高血脂癥的作用。

2.4 膳食對小鼠氧化應激水平的影響

表1 各組小鼠氧化應激水平Table1 Levels of oxidative stress in each group

如表4所示，與NC組相比，小鼠長期進食高脂飼料導致高脂飲食小鼠T-SOD、GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA水平升高。對小鼠進行低聚糖干預后，小鼠的氧化應激狀態有所改善。KOS組小鼠的T-AOC、T-SOD、GSH-Px水平與MC組相比顯著升高，MDA水平降低。這說明魔芋低聚糖干預對由高脂飲食引起的氧化應激有抑制作用。

2.5 膳食對小鼠LDL-R、CPT、PPARα mRNA表達水平的影響

圖2 各組小鼠LDL-R（A）、CPT（B）、PPARα（C）mRNA的相對表達量Fig.2 mRNA expression levels of LDL-R （A）, CPT （B）, and PPARα （C）in liver

如圖2所示，與正常小鼠相比，高脂飲食會導致小鼠肝臟內低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDL-R）、肉堿棕櫚酰轉移酶（carnitinepalmitoyltransferase 1a，CPT）、過氧化物酶增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）的mRNA表達顯著降低，而魔芋寡糖干預后小鼠肝臟內LDL-R、CPT的mRNA表達上調，而PPARα的mRNA表達與MC組并無顯著性區別。

3 討 論

近年來，尋找安全高效的食品活性成分來代替藥物防治慢性代謝疾病成為科學研究的熱點[16]。低聚糖因其發熱值極低（很少能轉化為脂肪），可改善脂代謝，降低血脂和膽固醇[17]。在本實驗中，在高脂飲食飼料中添加質量分數3%的魔芋低聚糖，通過對小鼠的體質量、肝指數、血脂及氧化應激水平等指標的測定，探索魔芋低聚糖對小鼠脂代謝及氧化應激的影響。

實驗結果表明，高脂飲食可以使小鼠體質量明顯上升，說明高脂飲食可以導致小鼠體內脂肪的積累。與NC組相比，實驗結束后MC組小鼠體質量明顯升高，低聚糖干預后小鼠體質量顯著降低。說明低聚糖干預可以抑制高脂飲食小鼠體質量的增加。高脂飲食會導致小鼠血液中的TC、TG水平異常升高，長期的高血脂水平會導致動脈粥樣硬化[18]。低聚糖干預后小鼠TC、TG、LDL-C水平顯著降低，HDL-C水平顯著提高，說明低聚糖對高脂飲食的小鼠有降低高血脂癥的作用，這與國內相關研究結果[19]一致。

很多臨床與實驗研究已經表明，在肥胖、血脂代謝紊亂狀態情況下，機體氧化應激水平也會升高[20]。氧化應激是指機體促氧化物-抗氧化物之間動態平衡失調所導致的對細胞內大分子的氧化損傷。高脂飲食可生成大量的活性氧，引起機體氧化應激[21]。過量的活性氧會引起蛋白質、脂肪、核酸等生物大分子的氧化損傷，是高血脂、肥胖、糖尿病等營養性慢性代謝疾病發生、發展的根源[22-23]。已有研究發現，高脂飲食可致組織中許多抗氧化應激系統酶表達減少、活性降低，導致機體清除氧自由基能力降低，從而對機體組織等造成損傷[24-25]。T-SOD對機體的抗氧-抗氧化平衡起著至關重要的作用，它能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。GSH-Px特異性催化還原型谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應，可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。MDA水平可以反映機體內脂質過氧化的程度。高脂飲食會顯著降低小鼠的T-AOC、T-SOD和GSH-Px（P＜0.05），提高MDA水平（P＜0.05），造成機體氧化應激水平升高。與MC組相比，低聚糖干預后小鼠的T-AOC、T-SOD和GSH-Px水平顯著提高，MDA水平降低，這說明魔芋低聚糖干預有助于抑制小鼠氧化應激狀態。

為了進一步研究KOS對脂質代謝調控的分子機制，我們研究了脂代謝相關基因，檢測脂質代謝相關基因。CPT能與長鏈脂酰輔酶A合成脂酰肉堿，并將其轉運至線粒體而被氧化分解[26]。CPT是脂肪分解代謝相關基因，高脂飲食雖然會導致小鼠肝臟內脂肪分解代謝相關基因CPT的mRNA表達顯著下調，表明高脂小鼠肝臟內脂肪降解減慢，多余脂肪肝臟內積累，但進行KOS干預后小鼠CPT的mRNA顯著上調，表明低聚糖干預可以使小鼠肝臟內脂肪降解加快，減少多余脂肪積累。LDL-R基因能夠移除血液LDL微粒中含有的膽固醇，對維持機體正常血液膽固醇水平具有重要作用[27]；LDL-R基因突變可以導致LDL-R功能異常和家族性高膽固醇血癥。上調LDL-R的表達可以降低血漿低密度脂蛋白膽固醇水平，降低心血管意外的發生率[28]。與NC組相比，KOS組小鼠LDL-R的mRNA顯著上調。PPARα可以通過激活脂肪氧化基因的表達促進脂肪的降解，在脂類代謝中起著重要作用[29]。與正常小鼠相比，高脂飲食會導致小鼠肝臟內PPARα的mRNA表達顯著降低，但進行KOS干預后PPARα的mRNA表達與高脂組小鼠并無顯著區別。

綜上所述：在高脂飼料中直接添加魔芋低聚糖可以顯著降低小鼠的體質量、肝指數、體脂比，改善血脂合成及氧化應激水平：顯著增加T-AOC、T-SOD和GSH-Px水平，降低MDA水平。說明魔芋低聚糖對高脂飲食小鼠具有降低體質量、肝指數、體脂比，改善血脂合成及抑制氧化應激的功效；魔芋低聚糖干預后小鼠顯著上調CPT的mRNA表達，表明脂肪分解代謝加快，顯著上調LDL-R mRNA的表達可以降低血漿低密度脂蛋白膽固醇水平。