基于iTRAQ技術研究采后1-甲基環丙烯和乙烯利處理對茭白線粒體蛋白質組變化的影響

羅海波，周 濤，孔曉雪，陶明煊，姜 麗，王利斌，王韋華，郁志芳,*

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095；3.南京農業大學園藝學院，江蘇 南京 210095）

衰老是導致茭白采后品質快速下降的重要因素，嚴重影響其商品品質和市場價值[1]。研究表明，抑制或延緩果蔬采后衰老可有效減少營養成分消耗損失、風味色澤改變及質地軟化或木纖化，提高果蔬抗病菌能力，降低腐爛率，從而維持果蔬采后品質和貯藏壽命[2]。因此，深入研究茭白采后衰老的生物學基礎，有助于為實踐中進一步研發精準的采后貯運保鮮新技術提供理論支撐。

關于衰老的生物學基礎研究，自19世紀末應用實驗方法研究以來，科研人員曾先后提出過多種假說，目前已知的果蔬采后衰老生物學基礎主要有營養虧缺假說、衰老基因調控學說、激素調控學說、自由基學說、細胞凋亡理論、死亡因子、端粒學說和差誤理論等，其中影響較為深遠的主要是激素調控學說、自由基學說、細胞凋亡理論和衰老基因調控學說[3-4]。目前，盡管這些學說對衰老現象的解釋都有不同的理論和實驗證據，但對采后衰老生物學基礎的清楚認識遠遠不夠，關于果蔬采后衰老生物學基礎的研究仍需繼續。

同位素標記相對與絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術是近幾年發展起來的一種高通量定量蛋白質組學技術，與傳統雙向電泳和熒光差異雙向電泳技術相比，具有定量準確、數據豐富、重復性好、分辨率高和自動化程度高等優勢，目前已廣泛應用于動物[5]、植物[6]、微生物[7]等材料的蛋白質組學研究中，結合生物信息學分析技術，獲悉了許多關于生長發育、生物與非生物脅迫、細胞生理功能等相關分子機理和調控機制。因此，對茭白采后衰老期間線粒體蛋白質表達譜進行研究，能夠更加全面準確地探明茭白采后衰老的生物學基礎。然而，應用iTRAQ技術對茭白采后衰老期間線粒體蛋白質組學的研究鮮見報道。

乙烯利（e t h y l e n e，E T）是果蔬常用的催熟劑，可以促進多種果蔬的成熟，1-甲基環丙烯（1-methyleyelopropene，1-MCP）可延緩果蔬采后衰老進程，保持果蔬良好的品質，二者在果蔬采后成熟衰老過程中均發揮重要生理作用[8]。本實驗擬采用i T R A Q結合二維液相色譜-串聯質譜（two-dimensional liquid chromatographytandem mass spectrometry，2D-LC-MS/MS）技術對茭白采后常溫貯藏期間以及ET和1-MCP處理后線粒體蛋白質表達譜進行比較，篩選差異表達蛋白并進行生物信息學分析，探索茭白采后衰老的生物學基礎，以期為茭白貯運保鮮新技術的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用茭白于6月下旬采自安徽大別山露天種植田，當天運回實驗室，充分散去田間熱后，挑選無感官異常、形態大小一致的茭白，自來水清洗，室溫下晾干。

ET、1-甲基環丙烯、蔗糖、甘露醇、聚乙烯吡烙烷酮、乙二胺四乙酸、L-半胱氨酸、牛血清白蛋白、Percoll、iTRAQ8 plex試劑盒（AB SCIEX）、Tris-HCl（pH 6.8、pH 8.5、pH 8.8）、溴酚藍、Bradford蛋白濃度測定試劑盒 南京壽德試驗器材有限公司；尿素、硫脲、二硫蘇糖醇、3-（3-（膽酰胺丙基）二甲氨基）丙磺酸內鹽、碘乙酰胺、IPG Buffer、甲酸、甲酸銨美國通用電氣公司；十二烷基硫酸鈉、三羧基氨基甲烷、甘氨酸、三氯乙酸、過硫酸銨、碳酸鈉、N,N,N’,N’-四甲基二乙胺 Amresco公司；三乙基碳酸氫銨緩沖液（triethylammonium bicarbonate buffer，TEAB）、蛋白酶抑制劑 美國Sigma公司；胰蛋白酶（Trypsin Gold）上海普洛麥格生物產品有限公司。其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SPX-320智能生化培養箱 寧波江南儀器廠；KQ-300DB超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；FRESCO 17微量高速冷凍離心機 美國Thermo電子公司；AJ-30i高速冷凍離心機、OptimaL-100XP超速冷凍離心機 美國Beckman公司；TGL-16M高速冷凍離心機 南京馳遠生物科技有限公司；5810/5810R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；ImageScanner掃描儀 美國Healthcare公司；FS-900N超聲波細胞粉碎機 上海生析超聲儀器有限公司；1200液相色譜儀 美國Agilent公司；Eksigent nanoLC-Ultra? 2D系統、TripleTOF 5600系統、Protein Pilot 5.0軟件 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 ET和1-MCP處理

將晾干的茭白分為3 組，每組取3 kg進行實驗，第一組在1 000 μL/L ET溶液中浸泡30 min后密封19.5 h，第二組在10 μL/L 1-MCP環境中密封20 h，第三組（對照）直接密封20 h，實驗設3 次重復，用高密度聚乙烯塑料袋敞口包裝，置25 ℃下貯藏0、3 d和6 d，取樣提取純化線粒體。

1.3.2 線粒體提取與純化

參照杜傳來等[9]的方法提取純化茭白線粒體，每個樣品進行3 次生物學重復，純化后的線粒體置于－70 ℃冰箱備用。

1.3.3 茭白線粒體蛋白iTRAQ分析

茭白線粒體蛋白iTRAQ分析委托上海鹿明生物科技有限公司進行。

1.3.4 蛋白定性和定量

質譜分析原始數據為.wiff文件，采用專用的Proteinpilot軟件打開進行分析。數據處理采用含Paragon algorithm算法的Protein Pilot Software v. 5.0進行，檢索的數據庫為水稻數據庫，數據庫來源于Uniprot。采用Cutoff Applied＞0.05、Global FDR from Fit≤1%且Peptide≥2為可信蛋白評判鑒定標準。

1.3.5 差異表達蛋白篩選

采用Excel軟件進行差異表達蛋白篩選，以對照組貯藏0 d為比較基準，組間蛋白變化倍數大于2.0或小于0.5，且P＜0.05為差異蛋白，將同一在任意比較組中為差異蛋白的蛋白均列出。

1.3.6 生物信息學分析

采用DAVID生物信息數據庫（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫（http://www.genome.jp/kegg/mapper.html）對差異蛋白進行基因本體（gene ontology，GO）分類注釋和功能分析。

2 結果與分析

2.1 茭白線粒體蛋白質譜鑒定結果

茭白線粒體iTRAQ定量蛋白質組學分析共獲得1 908 個可信蛋白，以每組貯藏0 d（CK0d）為相對定量參考標準，采用組間表達量變化倍數大于2.0 倍且重復組數據差異顯著性檢驗滿足P＜0.05的蛋白進行差異表達蛋白篩選，共獲得315 個差異表達蛋白（6 個比較組相同的差異蛋白僅統計1 次），詳細信息結果見表1。茭白貯藏期間差異表達蛋白數量顯著增多，對照組貯藏3 d和6 d后差異表達蛋白數量分別為79、121 個，其中上調表達差異蛋白分別為70、91 個，表明這些蛋白可能與茭白采后衰老密切相關。ET處理顯著提高了差異表達蛋白數量，貯藏3 d和6 d后分別為116、165 個，與對照組相比，ET處理組貯藏3 d后上調和下調差異表達蛋白分別增加了3、34 個，貯藏6 d后分別增加了44、0 個，這些增加的差異表達蛋白可能與ET促進茭白采后衰老有關。1-MCP處理也顯著提高了差異表達蛋白數量，貯藏3 d和6 d后分別為117、131 個；但與對照組相比，1-MCP處理組貯藏3 d和6 d后上調差異表達蛋白分別減少了40、6 個，下調差異表達蛋白分別增加了78、16 個，暗示1-MCP處理可能抑制了衰老相關蛋白的上調表達，從而延緩衰老。

表1 ET和1-MCP處理對茭白25 ℃貯藏期間線粒體蛋白表達譜的影響Table1 Effects of ethylene and 1-MCP on mitochondrial protein pro fi le in Z. latifolia during storage at 25 ℃

2.2 差異表達蛋白的生物信息學分析

圖1 差異表達蛋白的GO分類注釋Fig.1 GO annotation of the differentially expressed proteins

將篩選獲得的差異表達蛋白進行GO富集分析和KEGG通路分析，結果見圖1、2。圖1A、D顯示，茭白采后貯藏期間差異表達蛋白參與的生物學過程主要集中在單有機物代謝、單有機物生物合成、小分子代謝、有機酸代謝、細胞氨基酸生物合成、羧酸代謝及含堿基小分子代謝過程；參與的分子功能主要集中于催化活性、輔因子結合、裂解酶活性、磷酸吡哆醛結合、轉移酶活性及氧化還原酶活性。ET處理后有機氮化合物代謝、核苷酸代謝、含堿基小分子代謝和蛋白質折疊等生物學過程相關蛋白顯著富集，涉及分子功能主要包括氫離子跨膜轉運蛋白活性、4鐵/4硫簇結合、離子結合和陰離子結合等（圖1B、E）。1-MCP處理后有機氮化合物代謝、羧酸代謝、含氧酸代謝、有機氮化合物生物合成、含堿基小分子代謝和核苷酸代謝等過程相關蛋白顯著富集，涉及分子功能主要包括陰離子結合、過渡金屬離子結合、氧化還原酶活性、輔酶結合和碳氧裂解酶活性等（圖1C、F）。以上結果表明，茭白采后衰老響應差異表達蛋白具有多種分子功能，它們參與多類生物學過程，且主要集中在核苷酸代謝、有機酸代謝及含堿基小分子代謝等方面，ET和1-MCP處理顯著促進/抑制了部分生物學過程同時誘導了其他生物學過程，這些代謝過程可能在茭白采后衰老調控中發揮重要作用。

圖2 差異表達蛋白質顯著富集的KEGG通路Fig.2 The KEGG pathways for the most signif i cant enrichment of the differentially expressed proteins

圖2 A、D顯示，茭白采后常溫貯藏期間代謝途徑、次生代謝產物生物合成、氨基酸生物合成與代謝相關蛋白顯著富集。ET和1-MCP處理對茭白采后貯藏期間KEGG通路有顯著調控作用。與對照組相比，ET處理組貯藏3 d后氧化磷酸化和甘氨酸/絲氨酸/蘇氨酸代謝相關蛋白顯著富集（圖2B），貯藏6 d后磷酸戊糖途徑、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝相關蛋白顯著富集（圖2E）。1-MCP處理組貯藏3 d后三羧酸循環、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解途徑相關蛋白顯著富集（圖2 C），貯藏6 d后磷酸戊糖途徑、C 5支鏈二元酸代謝、纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸降解、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝途徑相關蛋白顯著富集（圖2F）。以上結果表明，ET和1-MCP處理顯著誘導了茭白采后貯藏期間KEGG通路相關蛋白的改變，這些通路可能與ET和1-MCP調控茭白采后衰老有密切聯系。

2.3 差異表達蛋白的生物學功能分析

蔬菜采后失去了養分供應來源，同化作用基本停止，異化作用占主導地位，成為利用自身營養物質進行生命活動的獨立個體。呼吸作用是蔬菜采后貯藏過程中最主要的生理代謝活動，是在多種復雜酶系統參與下經過許多中間反應步驟進行的生物氧化還原過程，同時直接聯系著其他各種生理生化代謝，從而制約著蔬菜品質變化、抗病能力和貯藏壽命[10]。植物呼吸作用在細胞質基質和線粒體中進行，且線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所[10]。本實驗采用iTRAQ標記結合2D-LC-MS/MS技術，以貯藏0 d（CK0d）為相對定量參考標準，研究比較了茭白采后常溫貯藏期間及ET和1-MCP處理后線粒體蛋白質表達譜差異，發現6 個處理組在常溫貯藏期間共有315 個蛋白（附表，未列出）表達量變化倍數在2.0 倍以上且重復組數據差異顯著（P＜0.05），這些差異蛋白廣泛參與呼吸代謝及其伴隨的物質代謝、能量代謝、活性氧代謝、細胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）和細胞結構降解等生物學過程，與前面生物信息學分析結果基本一致。

蔬菜呼吸代謝的底物主要是單糖，淀粉和蔗糖代謝可水解為單糖。本實驗中，7 個差異表達蛋白參與淀粉和蔗糖代謝，分別為4-α-葡聚糖轉移酶DPE1、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、蔗糖合酶1、蔗糖合酶7、β-葡萄糖苷酶6、β-葡萄糖苷酶26及Os03g0278000蛋白。4-α-葡聚糖轉移酶可催化1,4-α-D-葡聚糖轉移合成多糖、糖蛋白或糖脂的可逆反應[11]；α-1,4葡聚糖磷酸化酶能夠可逆催化麥芽寡糖、淀粉或糖原轉化為1-磷酸葡萄糖的磷酸化反應[12]；蔗糖合酶是廣泛存在于植物中的一種糖基轉移酶，能催化蔗糖的分解及合成反應[13]；β-葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一大類酶，能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基[14]。茭白常溫貯藏期間4-α-葡聚糖轉移酶、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、β-葡萄糖苷酶6、β-葡萄糖苷酶26和蔗糖合酶7表達量均顯著上調表達，蔗糖合酶1和Os03g0278000蛋白顯著下調表達。ET處理促進了貯藏6 d時4-α-葡聚糖轉移酶、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、β-葡萄糖苷酶6和β-葡萄糖苷酶26上調表達，1-MCP處理抑制了貯藏3 d時4-α-葡聚糖轉移酶、α-1,4葡聚糖磷酸化酶、β-葡萄糖苷酶6，但促進了β-葡萄糖苷酶26和蔗糖合酶7上調表達。以上結果表明，茭白采后常溫貯藏期間淀粉和蔗糖水解加速，1-MCP處理對茭白采后淀粉和蔗糖水解有一定延緩作用，ET處理則相反。

蔬菜呼吸代謝途徑有多種，主要包括糖酵解、發酵途徑、三羧酸循環、磷酸戊糖途徑和乙醛酸循環途徑[10]。本實驗中，經鑒定有4 個蛋白與糖酵解有關，包括果糖激酶-2、磷酸丙糖異構酶、丙酮酸激酶和丙酮酸脫羧酶；11 個蛋白與三羧酸循環有關，包括丙酮酸脫氫酶E1組成亞基α-1、檸檬酸合酶、2 個異檸檬酸脫氫酶亞基、異檸檬酸脫氫酶、2 個順烏頭酸酶、二氫硫辛酸脫氫酶、3 個蘋果酸脫氫酶；10 個蛋白與磷酸戊糖途徑有關，包括2 個6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、果糖二磷酸醛縮酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、葡萄糖-6-磷酸/磷酸轉運、Os01g0926300、Os05g0524400、Os06g0133800、Os07g0176900和Os08g0154300蛋白；未發現發酵途徑相關差異表達蛋白。對上述呼吸代謝途徑相關差異表達蛋白進一步分析發現，茭白采后貯藏期間3 個糖酵解相關蛋白顯著下調表達，1 個上調表達，三羧酸循環相關蛋白均有上調表達趨勢，但僅有蘋果酸脫氫酶達到2.0 倍以上差異，而磷酸戊糖途徑相關蛋白均顯著上調表達；ET處理顯著促進了貯藏第3天時糖酵解途徑相關蛋白下調表達趨勢，貯藏6 d時與對照組無顯著差異，同時提高了整個貯藏期間三羧酸循環、磷酸戊糖途徑相關蛋白上調表達趨勢；1-MCP處理顯著促進了整個貯藏期間糖酵解相關蛋白下調表達趨勢，同時抑制了三羧酸循環和磷酸戊糖途徑相關蛋白的上調表達趨勢。這一結果與ET和1-MCP處理對茭白采后貯藏期間呼吸強度的影響結果一致。而有研究表明，合成代謝中多處需要呼吸作用產生的ATP供能，糖酵解和三羧酸循環是植物獲得生命活動所需能量的主要途徑，盡管磷酸戊糖途徑的一些中間產物是許多重要有機物質（核酸、芳香族氨基酸等）生物合成的底物，但其提供的能量遠比三羧酸循環少得多[15]。由此推測，茭白采后貯藏期間糖酵解減弱，三羧酸循環和磷酸戊糖途徑增強導致的能量狀態改變可能與茭白采后衰老有密切聯系。

呼吸代謝過程中糖酵解、三羧酸循環和磷酸戊糖途徑等脫下的氫被NAD＋或黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FDA）所接受，它們進一步經呼吸電子傳遞鏈傳遞給O2生成H2O，同時偶聯ADP和Pi進行氧化磷酸化生成ATP[16]。本實驗中，19 個蛋白與呼吸電子傳遞鏈和氧化磷酸化有關，分別為NADH脫氫酶、電子轉移黃素蛋白α亞基、電子轉移黃素蛋白β亞基、NADH泛醌氧化還原酶23 kDa亞基、NADH泛醌氧化還原酶75 kDa亞基、黃素蛋白亞基琥珀酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶鐵硫亞基1、NADH-細胞色素b5還原酶、細胞色素c、ATP合酶、ATP合酶α亞基、ATP合酶β亞基、ATP合酶γ鏈、無機焦磷酸酶、Os02g0816800、Os04g0656100、Os07g0645400、Os08g0478200和Os12g0638700蛋白。茭白采后常溫貯藏期間僅5 個差異蛋白（黃素蛋白β亞基、ATP合酶α亞基、無機焦磷酸酶、Os04g0656100和Os12g0638700蛋白）上調表達，其余蛋白均下調表達或與貯藏第0天無顯著差異；ET處理顯著促進了貯藏第3天多數呼吸電子傳遞鏈和氧化磷酸化相關蛋白下調表達，貯藏第6天抑制作用減弱，其中ATP合酶α亞基和無機焦磷酸酶表達量顯著高于對照組；1-MCP處理延緩了多數呼吸電子傳遞鏈和氧化磷酸化相關蛋白下調表達。以上結果表明，茭白采后常溫貯藏期間呼吸電子傳遞和氧化磷酸化減弱，能量供應顯著減少，ET處理雖然促進了糖酵解和三羧酸循環，但減弱了氧化磷酸化，從而導致能量虧損，而1-MCP處理有利于維持較高的能量水平。

呼吸電子傳遞鏈在進行電子傳遞過程中，大部分的電子經過末端氧化酶如細胞色素氧化酶和交替氧化酶傳給O2生成H2O，但也會有少量電子“漏出”直接與O2結合形成·、H2O2和·OH等活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）[17]。在正常生命活動中，這些ROS可及時被細胞內酶類抗氧化系統和非酶類抗氧化系統清除并維持在一定的水平[18]。本實驗中，6 個蛋白與酶類抗氧化系統有關，分別為[Cu-Zn]超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、[Mn]SOD、過氧化氫酶（catalase，CAT）同工酶B、過氧化物還原酶-2F、2 個過氧化物酶（peroxidase，POD）；4 個蛋白與非酶類抗氧化系統有關，分別為L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶1、谷胱甘肽還原酶、2-半胱氨酸過氧化物還原酶BAS1和硫轉移酶。酶類抗氧化系統中，茭白采后常溫貯藏期間[Cu-Zn]SOD、[Mn]SOD、CAT同工酶B均顯著上調表達，2個過氧化物酶在貯藏第3天上調表達，貯藏6 d時下調表達，過氧化物還原酶-2F的表達在整個貯藏期間變化不大；ET和1-MCP處理在貯藏第3天均顯著抑制了[Cu-Zn]SOD、[Mn]SOD、CAT同工酶B上調表達，但促進了2 個POD上調表達，貯藏6 d時ET處理組出現相反的調控作用，這可能是ROS積累的重要原因；1-MCP處理顯著促進了整個貯藏期間[Cu-Zn]SOD和2個POD上調表達，提高了ROS清除能力。非酶類抗氧化系統中，谷胱甘肽還原酶、2-半胱氨酸過氧化物還原酶BAS1和硫轉移酶上調表達，L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶1下調表達。ET處理顯著抑制了貯藏3 d時L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶1、谷胱甘肽還原酶、硫轉移酶表達，促進了2-半胱氨酸過氧化物還原酶BAS1上調表達。上述ROS清除酶類的上調表達可能暗示線粒體受到ROS的氧化脅迫程度提高，ET和1-MCP處理對ROS代謝有調控作用。

研究表明，線粒體ROS代謝狀態可能在PCD中占據重要地位[19]。徐建興[20]進行細胞培養實驗發現，10－9mol/L水平的ROS促進細胞增殖，10－6mol/L水平的ROS引起PCD，10－3mol/L水平的ROS引起細胞的損傷死亡，表明ROS代謝狀態與PCD存在緊密聯系。目前關于植物線粒體內ROS的正常水平尚不清楚，但當ROS水平超出自身清除系統所及范圍時會使線粒體處于氧化脅迫狀態，引起線粒體呼吸鏈酶活性下降和膜脂過氧化水平增強以及DNA損傷，這將使呼吸電子傳遞鏈不通暢而導致漏電程度增高，造成ROS積累增多和呼吸鏈進一步受損，如此惡性循環使線粒體的ROS代謝狀態不斷惡化，進而激活PCD甚至導致細胞壞死[21]。本實驗中，盡管沒有直接證據證明ROS積累造成線粒體DNA損傷，但經鑒定有5 個差異表達蛋白（組蛋白H2A、H2A.1、H2A.6、H2B.10和H4）與遺傳物質的載體染色質相關。線粒體與原核細胞相似，沒有染色體，只有染色質[22]。染色質是間期細胞核內由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA組成的線性復合結構，是間期細胞遺傳物質的載體和存在形式[23]。茭白采后常溫貯藏期間5 個組蛋白均顯著下調表達，1-MCP處理抑制了5 個組蛋白下調表達趨勢，ET處理有相反的結果，暗示1-MCP處理可能通過降低ROS脅迫而減輕DNA損傷。同時，實驗還發現1 個蛋白（膜聯蛋白V）與PCD有關。膜聯蛋白V是一種檢測PCD的試劑，尤其在PCD早期檢測中靈敏度較高[24]。茭白采后常溫貯藏期間膜聯蛋白V顯著上調表達，貯藏3 d和6 d時分別為貯藏0 d的4.1305 倍和4.9659 倍，表明茭白采后貯藏期間PCD顯著升高。1-MCP/ET處理顯著抑制/促進了膜聯蛋白V上調表達，推測1-MCP處理可能維持了較好的ROS代謝狀態和能量供應水平，減輕了DNA損傷程度，從而抑制茭白采后貯藏期間PCD，延緩衰老。

呼吸代謝在提供生命活動所需能量的同時，還會產生許多中間產物，其中有些十分活躍，是進一步合成其他有機物如蛋白質、氨基酸、脂肪、核酸以及次生代謝產物的物質基礎，并廣泛參與相應的生理過程[10]。本實驗中，與蛋白質代謝、氨基酸代謝、脂類代謝、核酸代謝、有機酸代謝及次生代謝相關的差異表達蛋白分別有36、58、15、8、13 個和14 個。對上述代謝相關蛋白的差異表達趨勢分析發現，茭白采后常溫貯藏期間23 個蛋白質合成相關蛋白中僅有6 個上調表達，而13 個蛋白降解相關蛋白中有11 個上調表達；氨基酸代謝相關差異表達蛋白涉及20 種氨基酸的合成和鳥氨酸循環，多數氨基酸合成相關蛋白在貯藏期間上調表達，鳥氨酸循環相關蛋白均顯著上調表達；脂類代謝相關蛋白中3 個甘油酯代謝、2 個脂肪水解、1 個脂肪酸氧化、6 個脂肪酸生物合成、2 個鞘脂代謝相關蛋白均上調表達，1 個磷脂代謝相關蛋白下調表達；核酸代謝相關蛋白中7 個上調表達，1 個下調表達；有機酸代謝相關蛋白中10 個蛋白上調表達，3 個蛋白與貯藏0 d無顯著差異；次生代謝相關蛋白中13 個上調表達，1 個下調表達。以上結果表明，茭白采后常溫貯藏期間蛋白質合成減弱而降解增強，氨基酸合成和鳥氨酸循環顯著提高，脂肪合成和脂質氧化反應均加速，核酸、有機酸及次生代謝也顯著加快，這可能與茭白采后貯藏期間物質分解消耗增多，需要更多地合成相應物質以維持正常的生理功能有關。1-MCP處理對上述物質代謝相關蛋白表達有顯著的抑制作用，ET處理有促進作用，表明1-MCP處理有利于延緩物質分解消耗。

需要特別指出的是，1-MCP處理在貯藏第3天對絕大多數物質代謝相關蛋白的上調/下調表達有抑制作用，但顯著促進了次生代謝相關蛋白細胞色素P450 74A2和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）上調表達。細胞色素P450 74A2編碼丙二烯氧合酶，該酶可以轉化由LOX催化衍生的脂肪酸氫過氧化物成不穩定的重要脂類中間體丙二烯氧化物，再經丙二烯氧化物環化酶、12-氧-植物二烯酸還原酶等催化生成茉莉酸[25]。茉莉酸類是植物傷反應中的重要信號分子，在植物防御機制中發揮至關重要的作用[25]。那么這是否暗示1-MCP處理提高了茭白采后對外界不良環境的防御能力而延緩衰老，還有待進一步的實驗證實。

呼吸代謝中間產物與植物細胞壁物質的合成與也有緊密聯系，細胞衰老過程中伴隨著細胞壁化學組成的變化[26]。本實驗中，經鑒定有3 個蛋白與纖維素合成有關，3 個蛋白與木質素合成有關。茭白采后常溫貯藏期間3 個纖維素合成相關蛋白（纖維素合成酶催化亞基1[UDP]、纖維素合成酶催化亞基5[UDP]、纖維素合成酶催化亞基8[UDP]）均顯著下調表達，而3 個木質素合成相關蛋白（3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基轉移酶、脫氫奎尼酸脫水酶、肉桂酸-4-羥化酶）均顯著上調表達，1-MCP處理對纖維素合成相關蛋白無顯著影響，但抑制了木質素合成相關蛋白上調表達，表明茭白采后木質化是其衰老的一個重要特征。這一結果與前期研究中發現茭白貯藏過程中酚類物質和木質素含量顯著上升的結果一致。

茭白采后常溫貯藏期間可能與衰老相關的其他差異表達蛋白中，信號轉導相關蛋白10 個，脅迫響應與防御相關蛋白20 個，內吞作用相關蛋白8 個，吞噬體和輔助因子相關蛋白各3 個，磷酸肌醇代謝、ABC轉運、同源重組、蛋白質互作、外膜結構維持和線粒體分裂相關蛋白各1 個。

細胞信號轉導是細胞外因子通過與受體（膜受體或核受體）結合，引發細胞內一系列生化反應及蛋白間相互作用，從而影響細胞生物學功能的過程[27]。研究表明，蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白質磷酸化與去磷酸化在生物體細胞信號轉導過程中扮演重要角色，涉及如光合作用、糖代謝、細胞生長發育及基因表達等幾乎所有的生理及病理過程。本實驗發現6 個信號轉導相關蛋白（磷脂酰肌醇磷脂酶C、EF手型鈣結合蛋白、類受體蛋白激酶1、MAP3K類蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、2C類蛋白磷酸酶41）顯著上調表達。一般認為，植物對外界刺激的反應主要是通過細胞質中Ca2＋濃度的瞬間變化來傳遞的[28]，磷脂酰肌醇磷脂酶C可誘發Ca2＋從胞內儲庫中釋放出來，瞬間增加細胞質中Ca2＋濃度[29]，EF手型鈣結合蛋白通過與Ca2＋結合成為激活態，在體內參與多種生物學功能[30]。植物類受體蛋白激酶1屬于蛋白激酶的一個亞家族，通過胞外結構域識別病原信號分子，發生磷酸化或去磷酸化反應而開啟或關閉下游靶蛋白，將胞外信號轉換為胞質信號[31]。MAP3K類蛋白和2C類蛋白磷酸酶41均是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[32]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶幾乎參與所有生理及病理等逆境脅迫響應和信號轉導過程[32]。目前已經發現水稻抗白葉枯病基因Xa21[33]、番茄抗假單孢菌基因Pto[34]和玉米抗葉銹病基因Lr10[35]等抗病基因都編碼受體樣蛋白激酶，并含有絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶結構域。以上6 個信號轉導相關蛋白顯著上調表達暗示鈣信號途徑可能是茭白采后衰老響應的重要途徑，茭白常溫貯藏期間受到的生物性脅迫顯著增加，造成茭白自身防御能力下降，9 個脅迫響應與防御相關蛋白的顯著上調表達進一步予以證實。1-MCP處理顯著抑制了上述6 個信號轉導蛋白上調表達，表明1-MCP處理提高了茭白對外界不良環境的防御能力而使脅迫響應減弱。

圖3 茭白采后衰老可能的信號通路Fig.3 Possible signaling pathways involved in postharvest senescence of Zizania latifolia

與此同時，4 個信號轉導相關蛋白（GTP結合蛋白Rab6、線粒體Rho GTP酶、腺苷酸環化酶相關蛋白、C2結構域蛋白）下調表達。G蛋白普遍存在于真核生物細胞中，其中植物細胞信號轉導G蛋白主要有3 類：異三聚體G蛋白、小G蛋白和幾種特殊的GTP結合蛋白[36]，而小G蛋白又包括5 個亞家族，即Ras、Rho、Rab、Arf和Ran，每個亞家族在細胞中起著不同的調控作用[37]。研究表明，Rho家族成員可能參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）的細胞信號轉導和肌動蛋白重組過程調控，Rab家族參與膜轉運過程[38]。腺苷酸環化酶可催化ATP分解生成3’,5’-環磷酸腺苷（cAMP）和焦磷酸（ppi），是cAMP跨膜信號轉導體系中的重要效應器[39]。C2結構域蛋白大多定位于細胞膜系統，可能參與了逆境信號轉導途徑或膜轉運[40]。本實驗中，GTP結合蛋白Rab6和Rho GTP酶均隸屬于小G蛋白Ras超家族，且激活型G蛋白（Gs）可介導受體與腺苷酸環化酶之間的相互作用，從而激活腺苷酸環化酶，調節胞內第二信使cAMP水平，將細胞外信號轉變為細胞內信號[41]。本實驗中上述4 個蛋白均下調表達，這一結果與王韋華等[1]在研究完整茭白常溫貯藏期間總蛋白表達譜差異時發現Ras相關小G蛋白和C2結構域蛋白下調表達結果一致，但與鮮切茭白貯藏期間顯著上調表達相反，表明cAMP信號途徑與傷脅迫響應密切相關但對衰老的響應并不明顯。

綜合上述分析，參考Cell Signaling Technology, Inc.（https://www.cellsignal.com/contents/ research/science/science）所提供的已知信號轉導相關通路，推測茭白采后衰老過程中可能通過ROS激活Ca2＋/MAPKs、細胞色素c和茉莉酸等信號參與茭白采后衰老調控，其可能的信號轉導通路見圖3。

內吞作用、吞噬體、輔助因子相關蛋白、磷酸肌醇代謝、ABC轉運、同源重組及蛋白質互作等相關蛋白中僅有類MDR ABC轉運蛋白、發夾結構1結合蛋白和Os05g0303000蛋白顯著上調表達，其余蛋白均顯著下調表達，但這些蛋白與茭白采后衰老的確切關系尚不清楚，還有待進一步深入研究。

此外，39 個差異表達蛋白經鑒定既沒有確切的名稱，也沒有相應的KEGG通路，其中22 個蛋白在茭白采后常溫貯藏期間上調表達，17 個蛋白下調表達，ET處理對少數蛋白的表達趨勢有促進作用，1-MCP對多數蛋白的表達趨勢有抑制作用，表明它們可能與茭白采后衰老存在一定聯系。

3 結 論

應用iTRAQ技術共鑒定獲得茭白線粒體蛋白質1 908 個，以貯藏第0天（CK0d）為相對定量參考標準，茭白貯藏期間及ET和1-MCP處理茭白線粒體表現2.0 倍以上顯著差異（P＜0.05）的蛋白質共計315 個。

代謝途徑、次生代謝產物生物合成、氨基酸生物合成與代謝、核苷酸代謝、含堿基小分子代謝途徑等可能與茭白采后衰老有關，三羧酸循環、氧化磷酸化、磷酸戊糖途徑、C5支鏈酸代謝及氨基酸代謝途徑可能在茭白采后衰老過程中發揮重要作用。

茭白采后碳水化合物水解加速，磷酸戊糖途徑加強而糖酵解途徑和氧化磷酸化減弱，導致能量合成減少同時形成氧化脅迫，這可能激活Ca2＋/MAPKs、細胞色素c和茉莉酸等信號途徑，造成初級代謝紊亂和次級代謝產物（如木質素）積累，從而促進細胞凋亡或細胞壞死，最終加速衰老。

茭白采后衰老過程中可能通過ROS積累激活Ca2＋/MAPKs、細胞色素c和茉莉酸等信號進行調控，而cAMP信號途徑與傷脅迫響應密切相關但對衰老的響應并不明顯，茉莉酸信號和磷酸肌醇信號可能協同鈣信號在茭白采后衰老過程中發揮作用。

然而，以上差異表達蛋白的生物學功能及其相互作用仍待進一步驗證，相關通路與茭白采后衰老的確切關系還需深入研究。