饅頭主要品質性狀SNP標記全基因組關聯分析

吳 澎，劉 娟，陳廣鳳，李向陽，趙子彤，楊 藝，唐曉珍，田紀春

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東 泰安 271018；2.德州學院生態與園林建筑學院，山東 德州 253023；3.山東農業大學小麥品質育種研究室，作物生物學國家重點實驗室，山東 泰安 271018）

饅頭是深受我國人民尤其是北方人民喜愛的傳統主食，年消費量約占全國面制品的46%，在我國的飲食文化以及人們日常生活中占有重要的地位[1-2]。隨著當前人們生活水平的逐漸提高，對面制品的要求已不僅是滿足飽腹，還要求具有良好的感官特性。因此，改良饅頭用面粉品質對提高饅頭整體價值具有重要意義。但目前對于饅頭品質的研究多傾向于復配粉、添加劑等加工條件方面[3-12]，未能從影響饅頭品質的內部因素即原料小麥基因位點的多態性角度進行研究。

全基因組關聯分析是指利用一定數量的標記對所選材料的目標性狀進行性狀/標記間的關聯定位的分析方法。最初應用于人類致病基因的研究[13-14]，Thornsberry等[15]首次將關聯分析技術引入進植物領域，之后便迅速應用于多種植物的研究[16-21]。目前，對于小麥的研究已比較成熟，Yao Ji等[22]以103份冬小麥為材料對小麥4A和2A染色體上的簡單重復序列標記與農藝性狀進行關聯分析，檢測到與目標性狀顯著關聯的簡單重復序列標記；Freddy等[23]利用單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism markers，SNP）標記對來自于智利、烏拉圭和國際玉米和小麥改良中心的382 個小麥品種進行全基因組關聯分析，得到與小麥千粒質量、株高、產量相關的穩定基因，并發現位于染色體1A、3A和5A上的QTL可增加小麥水分利用率，從而減少水資源的浪費；Gao Liangliang等[24]利用SNP標記對小麥抗莖銹病基因進行研究，發現了21 個SNP位點，其中10 個與抗莖銹病基因Sr42有密切關聯，抗病基因的獲得為篩選抗病植株做出較大貢獻。全基因組關聯分析技術在小麥作物上的成功應用為鑒定饅頭品質相關位點提供了新的思路和技術支持。本研究以205 份不同小麥品種為實驗材料，通過全基因組關聯分析，旨在得到與饅頭品質性狀緊密關聯的SNP標記，為下一步結合分子育種技術改良饅頭用面粉品質提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為205 種來自不同國家與地區的小麥品種，其中203 份來自中國10 個種植冬小麥的省份，剩余2 份分別來自于法國與墨西哥（表1）。供試材料中骨干親本為132 份，高代品系73 份，高代品系均來源于山東省。

表1 供試小麥材料Table1 Information about wheat varieties used in this study

1.2 儀器與設備

TA-XT2i型質構儀 美國Stable Micro System公司；BL-220H型分析天平 島津國際貿易（上海）有限；SF17和面機 意大利Alaska公司；CR-300型色彩色差計日本美能達公司；VF-30醒發箱 廣州富康食品機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗材料表型鑒定

在2014—2015年和2015—2016年間，分別將205 份不同小麥品種種植于山東省德州市農業科學院與山東省泰安市山東農業大學試驗田。種植條件為：每份材料播種3 行，行長2 m，行間距0.25 m，每行播種70 粒，重復2 次。小麥生長期間，進行常規田間管理，沒有出現嚴重的病蟲害現象。

小麥成熟后，進行收割，并研磨成面粉，將面粉按照最初來源進行編號后參照周素梅等[25]的實驗室饅頭制作方法并略作改進。待饅頭冷卻后測量饅頭的質量，饅頭的體積采用菜籽置換法測量，體積與質量之比即為比容[26]。取每個饅頭外表皮的表面頂端為外表面色澤測量點，選取的外表面測量點要求平整光滑，以確保所測結果的準確性，用色差儀測量其L*、a*、b*值，重復3 次。測量結束后，用切割機將饅頭平行切割成3 片，取中間片的內瓤中間位置作為內表面測量點，測量其L*、a*、b*值，重復3 次。測量結束后，取饅頭中間片置于質構儀上，在TPA模式下采用P35探頭進行壓縮實驗[27]，測試前速率3.00 mm/s，測試和測試后速率1.0 mm/s，壓縮距離50%。第1次壓縮結束后，探頭回到起始位置，等待3 s后進行第2次壓縮。

1.3.2 DNA提取和90K SNP芯片分型

根據稍作改動的Triticarte方法從不同品種小麥幼葉組織中提取DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對DNA濃度和質量進行測定。委托加利弗尼亞大學生物技術檢測中心，使用最新開發的包含81 587 個SNP位點的小麥90K基因芯片對DNA數據進行分型，并用GenomeStudio軟件讀取分型結果并保存。為確保分型數據結果的質量，用PLINK v1.07[28]進行檢測，選取低基因頻率大于5%和檢出率大于80%的SNP標記用于饅頭品質性狀關聯分析[29]，最終得到24 355 個SNP位點。

利用Wang Shichen等[30]整合的遺傳位點信息，對本研究獲得的基因位點進行整合，得到實驗群體SNP復合遺傳圖譜信息（表2）。

表2 SNP復合遺傳圖譜信息Table2 Information about SNP in the integrated linkage map

1.3.3 性狀與標記間的關聯分析

運用TASSEL 3.0軟件中的MLM_Q+K模型對饅頭比容、色澤和質構性狀與標記之間進行關聯分析，當結果中關聯標記P值小于0.001時，認為該標記與目標性狀存在顯著關聯；P值小于0.000 1時，認為標記與目標性狀存在極顯著關聯，當標記在2 個及以上環境中同時被檢測到則認為其是目標性狀相對穩定的關聯位點。

1.4 數據處理

利用SPSS 18.0軟件與TASSEL 3.0軟件統計分析所得數據。

2 結果與分析

2.1 比容、色澤與質構性狀表型變異分析

4 個環境下饅頭比容、色澤與質構的表型數據如表3～5所示。各性狀均有較大的變異系數，表3中，E4環境下饅頭比容性狀的變異系數最大（19.54%），E1環境下變異系數最?。?.45%）；表4中，色澤相關性狀在E1環境下內表面a*值變異系數最大（71.73%），E4環境下外表面L*值變異系數最?。?.70%）；表5中，E1環境黏著性變異系數最大（58.50%），彈性變異系數最?。?.21%）。除個別環境外，各性狀的偏度和峰度的絕對值大部分都小于1，符合正態分布，表現為數量性狀遺傳，適合進行關聯分析。

表3 4 個環境下饅頭比容在群體中的表型數據Table3 Phenotypic data of specific volume traits of steamed bread in four different environments

表4 4 個環境下饅頭色澤相關性狀在群體中的表型數據Table4 Phenotypic data of color traits of steamed bread in four different environments

表5 4 個環境下饅頭質構在群體中的表型數據Table5 Phenotypic data of texture traits of steamed bread in four different environments

2.2 SNP標記與性狀的關聯分析

表6 4 個環境中與饅頭比容性狀相關的極顯著、高貢獻率和穩定位點Table6 Highly significant marker-trait associations (MTAs), MTAs with high genetic contribution and stable MTAs for specific volume traits of steamed bread in four environments

通過對性狀與標記的關聯分析，在顯著水平（P＜0.001）上，共得到42 個比容性狀顯著關聯位點，分布于小麥21 條染色體中的16 條，單個位點遺傳變異貢獻率（R2）為6.57%～18.31%。其中8 個極顯著關聯位點（P＜0.000 1），同時也是高遺傳變異貢獻率位點，2 個相對穩定位點（至少在兩個環境中同時被檢測到），分布于小麥的2A、2B、2D、3A、4B、6B、7A染色體上。位于7A染色體上的極顯著關聯位點wsnp_Ex_c14654_22713386遺傳變異貢獻率最大，可解釋18.31%的表型變異，但只在E4環境中檢測到（表6）。

表7 4 個環境中與饅頭色澤相關性狀極顯著（P＜0.000 1）、高貢獻率和穩定位點Table7 Highly significant MTAs, MTAs with high genetic contribution and stable MTAs for color traits of steamed bread in four environments

4 個環境中共檢測到276 個饅頭色澤性狀關聯位點，其中23 個極顯著關聯位點，9 個相對穩定關聯位點，30 個高遺傳變異貢獻率位點，分布于小麥21 條染色體中的13 條（1A、1B、1D、2A、2B、3A、3B、4A、5B、6A、6D、7A和7D），單個位點遺傳變異貢獻率為7.00%～14.07%。位于7A染色體上的極顯著位點Kukri_c18677_823表現出最大的遺傳變異貢獻率，可解釋14.07%的表型變異，但只在E4環境中檢測到（表7）。

表8 4 個環境中與饅頭質構相關性狀極顯著、高貢獻率和穩定位點Table8 Highly significant MTAs, MTAs with high genetic contribution and stable MTAs for texture traits of steamed bread in four environments

通過對饅頭質構性狀進行關聯分析，共檢測到313 個質構性狀顯著關聯位點，分布于小麥的17 條染色體上，單個位點遺傳變異貢獻率為5.49%～25.14%。其中31 個極顯著關聯位點，11 個相對穩定關聯位點，46 個高遺傳變異貢獻率位點，分布于小麥的15條染色體上（1A、1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、5A、5B、5D、6A、7A、7B 和7D）。同時，檢測到5 個極顯著位點，如2D染色體上黏聚性關聯位點Kukri_c13329_800、7B染色體上咀嚼性關聯位點Tdurum_contig61884_836等，在兩個環境中表達，且貢獻率大于10%，為主效關聯位點（表8）。

3 結 論

利用24 355 個分布于小麥全基因組的SNP位點對205 種小麥粉饅頭的主要品質性狀（比容、色澤、質構）進行關聯分析。檢測到42 個饅頭比容性狀顯著關聯位點，其中8 個極顯著（P＜0.000 1）且高遺傳貢獻位點，2 個相對穩定關聯位點，分布于小麥的7 條染色體上；276 個饅頭色澤性狀顯著關聯位點，其中23 個極顯著關聯位點，9 個相對穩定關聯位點，30 個高遺傳變異貢獻率位點，分布于小麥的13 條染色體上。313 個饅頭質構性狀顯著關聯位點，其中31 個極顯著關聯位點，11 個相對穩定關聯位點，46 個高遺傳變異貢獻率位點，分布于小麥的15 條染色體上。同時，檢測到5 個質構性狀主效關聯位點。這些位點的獲得可用于結合小麥分子輔助育種技術，為改良饅頭用小麥粉鑒定基礎。