血清miR-210和miR-375在非小細胞肺癌患者中的表達變化情況

肖 灑，蔡 宙，鐘欣超，李玉嬋，吳科鋒，孫 杰，李文德，黃 韌，鄧少嫦△

(1.廣東醫科大學廣東天然藥物研究與開發重點實驗室,廣東湛江 524023；2.廣東醫科大學附屬醫院呼吸內科,廣東湛江 524023；3.廣州市外顯子生物技術有限公司,廣東廣州 510663；4.廣東省第二人民醫院腫瘤二科,廣東廣州 510663；5.廣東省實驗動物監測所/廣東省實驗動物重點實驗室,廣東廣州 510663)

肺癌已成為全球腫瘤死亡的主要原因之一[1]。據中國癌癥統計數據報告，截至2015年，中國共出現有430萬癌癥病例，且死亡病例數超過281萬，其中，肺癌的死亡人數超過所有死亡人數的21%[2]。非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數的85%，主要包括腺癌、鱗癌和大細胞未分化癌[3]。NSCLC的癌細胞生長分裂較慢，且擴散轉移也比較晚，大部分肺癌患者確診時已為中晚期。因此，尋找有效的早期診斷標志物是降低肺癌患者死亡率的關鍵[4-5]。

微小RNA(miRNA)是真核生物中一類長度約為22 nt的非編碼小分子單鏈RNA。研究表明，miRNA通過與靶mRNA 3′非編碼區(3′UTR)完全或不完全結合，抑制其靶mRNA翻譯或直接誘導其降解，在轉錄或轉錄后水平發揮調控作用[6-7]。大量研究表明，miRNA參與機體多種生理和病理過程[8-10]，且可通過調控其靶基因參與信號通路調控，并參與肺癌的發生、侵襲、轉移等過程[11-13]。

miRNA廣泛存在于各種體液中，血清就是其中之一。MOTAWI 等[14]報道，循環miRNA在多種腫瘤發生、發展和預后判斷中起重要調節作用，可成為早期診斷標志物。但是，循環miRNA在肺癌發生、侵襲、轉移等過程中的作用還有待于深入研究。朱利群等[15]報道，NSCLC患者血清miRNA-200b表達水平顯著上升，有可能成為新型的肺癌標志物，作為無創早期診斷NSCLC的指標之一。SUN等[16]通過對比60例NSCLC患者和30例健康人的血清miRNA發現，miR-210表達升高可作為NSCLC診斷依據，且通過36例接受過3次左右鉑類化療的NSCLC晚期患者的療效發現，穩定疾病進展組比局部緩解組患者血清miR-210表達更高，提示miR-210可在肺癌治療中起到治療反饋作用。HALVORSEN 等[17]通過聯合6個外周血miRNA(miR-429、miR-205、miR-200b、miR-203、miR-125b和miR-34b)可區分早期NSCLC患者、慢性阻塞性肺疾病患者和健康體檢者，且它們診斷NSCLC患者的曲線下面積(AUC)為0.89。因此多個miRNA聯合檢測有助于提高肺癌的靈敏度和早期診斷率。本研究選取9個已經報道過在肺癌患者血清中差異表達的miRNA (miR-182、miR-126、miR-31、miR-21、miR-221、miR-200b、miR-183、miR-210、miR-375)，作為研究目標，通過初篩和進一步確認發現，miR-210在肺腺癌中顯著上調，可作為肺腺癌早期診斷的生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇廣東醫科大學附屬醫院和廣東省第二人民醫院呼吸內科2016年3-12月確診的NSCLC患者25例(NSCLC組)，其中男14例，女11例；年齡39～83歲，平均66.0歲；肺腺癌13例(肺腺癌組)，鱗癌12例(肺鱗癌組)；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期3例，Ⅲ、Ⅳ期22例。納入標準：(1)NSCLC均經病理學確診，符合美國胸科醫生學會(ACCP)肺癌診治標準[18]；(2)按美國聯合癌癥分類委員會(AJCC)和國際癌癥研究協會(IASLC)2009 年制定的TNM分期標準(第7版)進行分期[19]；(3)具備完整的臨床診斷、治療資料；(4)獲得標本前患者未經過放療、化療等治療；(5)吸煙者定義為吸煙總數超過100支。以上患者均按照世界衛生組織(WHO)肺癌分類標準進行診斷。另選擇健康志愿者14例作為對照組，其中男10例，女4例；年齡17～71歲，平均53.5歲；無高血壓、高血脂、糖尿病等基礎性疾病。所有標本采集均獲得患者及主管醫生同意，且所有參與者均簽訂知情同意書。

1.2儀器與試劑 Applied Biosystems 7500 熒光定量PCR儀購自ABI公司；Trizol試劑購自Life Technology公司；RTase M-MLV(RNase H-)試劑購自TAKARA公司；熒光定量 PCR試劑盒購自Vazyme公司；引物設計與合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3方法

1.3.1標本處理 空腹抽取1～3 mL外周靜脈血置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，在室溫條件下，4 000 r/min離心5 min，取最上層0.2～0.5 mL血清至無菌凍存管。

1.3.2血清總RNA提取 采用Trizol法提取血清總RNA。使用超微量紫外分光光度計測定RNA的A260/A280及RNA濃度。RNA的A260/A280在1.8～2.1時，判斷其純度合格。

1.3.3miRNA逆轉錄 miRNA逆轉錄參照RTase M-MLV (RNase H-)試劑說明書進行。反應體系：RNA 1.0 μg，Olig(dT)18 0.5 μL，隨機引物 0.5 μL加入RNase free ddH2O至12 μL，70 ℃ 10 min后迅速冷卻1 min；然后加入10 mmol/L dNTP Mixture 0.5 μL、RNase inhibitor (40 U/μL) 0.25 μL、5×M-MLV buffer 4.0 μL、RTase M-MLV(RNase H-) 0.5 μL，加入RNase free ddH2O至20 μL，混勻后42 ℃恒溫60 min，72 ℃滅活15 min，最后-20 ℃保存備用。

1.3.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 反應體系(20 μL)：cDNA 2 μL，正、反向引物各0.5 μL，AceQTMqPCR SYBR?Green Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。循環參數：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，共40個循環。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1血清中與肺癌相關的miRNA 通過PubMed、萬方和知網等文獻搜索引擎，共發現9個在肺癌患者血清中差異表達的miRNA，將這9個miRNA作為研究目標，探討其對肺癌的臨床診斷價值。見表2。

2.2血清中總RNA分析 采用Trizol法提取血清中總RNA，其A260/A280值均在合格范圍內，RNA質量濃度符合RT-qPCR的要求，見表3。

表2 血清中與肺癌相關的miRNA

注：SCLC為小細胞肺癌；↓表示miRNA表達下調；↑表示miRNA表達上調

注：A～I分別為miR-21、miR-31、miR-221、miR-126、miR-182、miR-200b、miR-183、miR-210、miR-375在血清中的相對表達情況

圖1 各miRNA在NSCLC組和對照組血清中的相對表達水平

注：N1～N6為健康人血清標本；Ca1～Ca3為肺癌患者血清標本

2.3miRNA PCR引物特異性驗證 9種miRNA及內參U6在內共10種基因均成功擴增出產物，且溶解曲線均為單峰，提示產物具有良好的特異性，引物設計成功。

2.4篩選實驗結果 血清miR-210和miR-375在NSCLC組相對表達量較對照組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，與文獻報道一致；而其余7種血清miRNA(miR-182、miR-126、miR-31、miR-21、miR-221、miR-200b、miR-183)相對表達量在NSCLC組與對照組的差異與文獻報道不符，見圖1。故選擇miR-210和miR-375進行進一步研究。

注:A為各組miR-210在血清中的相對表達水平，B為各組miR-375在血清中的相對表達水平

圖2 miR-210和miR-375分別在各組血清中的相對表達水平

2.5各組血清miR-210和miR-375的表達情況及其對于NSCLC的診斷價值 檢測19例NSCLC組患者(10例肺鱗癌和9例肺腺癌)與8例對照組血清中2種目標miRNA(miR-210和miR-375)相對表達情況，見圖2。NSCLC組患者中，肺腺癌組血清中miR-210的表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；肺鱗癌組患者血清miR-210較對照組有減少趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；miR-375在肺鱗癌組和肺腺癌組患者血清中表達無差異，其原因需要進一步探究。采用ROC曲線評價miR-210在肺腺癌診斷效能，其AUC為0.737 5(95%CI：0.498 3～0.976 7，P=0.091 4)，見圖3。

圖3 miR-210 對肺腺癌診斷的ROC曲線分析

3 討 論

由于肺癌存在高轉移、高復發和對化療不敏感等特點，導致多數患者診斷時已屬于晚期并有轉移，錯過了最佳手術時機，已成為嚴重危害人類健康的疾病[28-29]。近年來，雖然肺癌診斷治療技術不斷提高，但是仍缺乏對肺癌早期診斷、治療、評估、預后判斷有效的生物學標志[30]。因此，尋找新的、高靈敏度的肺癌早期診斷指標具有重要臨床意義。

有研究表明，人體體液如血漿或血清中的循環miRNA可穩定存在，獲得含有循環血miRNA的臨床標本是簡單非侵入的過程，且可通過實時定量PCR檢測其表達水平[27]；檢測到的血清或血漿循環miRNAs的表達譜中有許多種miRNA，可排除只檢測一種指標而判定為假陽性的干擾，從而提高肺癌診斷的特異度、靈敏度和可信度。因此，循環血miRNA可成為有臨床價值的生物標志物。

本研究在目標miRNA的篩選過程中發現，7種與肺癌相關的miRNA表達水平與文獻報道結果不一致[31-32]，分析可能存在以下2種可能：(1)篩選實驗的樣本數較少，不能完全反映出這7種miRNA在總體中的真實表達水平；(2)血清中miRNA來源復雜，miRNA組織特異性較差，且可能由其他組織釋放入血清導致這7種miRNA在血清中的真實表達情況被掩蓋了。

本研究結果顯示，血清miR-210的表達水平在肺腺癌患者中顯著上調，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。然而，血清miR-210在肺鱗癌患者和對照組中表達差異無統計學意義(P>0.05)，具體原因還需進一步研究。與對照組相比，血清miR-375在肺腺癌和肺鱗癌中的表達差異無統計學意義(P>0.05)。本研究引入ROC曲線評價miR-210對肺腺癌患者的診斷效果，結果顯示，其AUC為0.737 5(95%CI：0.498 3～0.976 7)，說明其對肺腺癌的診斷具有中等效果。因此可推斷，血清miR-210有可能作為肺腺癌早期診斷的一個較好的輔助診斷指標。

本研究也存在一些缺陷，比如標本量小，未進行進一步的分子機制研究等，實驗結果可能具有一定局限性，但是該研究豐富了血清miR-210用于肺腺癌患者診斷、治療和預后的認知。血清miR-210檢測用肺腺癌患者診斷需要擴大樣本量，再進行深入探討，以期對肺腺癌的診斷、監測及治療發揮積極作用。

4 結 論

miR-210在肺腺癌患者中呈高表達，可成為診斷肺腺癌的新型腫瘤標志物。對于如何探索檢測miR-210更精確的方法，做好質量控制，以及將血清miR-210運用于臨床肺腺癌的早期診斷，使其具有更高的準確性等方面需要進行更深入的研究。