穿孔素及顆粒酶B 與布魯菌病相關性研究進展

高國棟，其其格

（內蒙古醫科大學附屬醫院，內蒙古 呼和浩特 010030）

1 布魯菌病的簡介

1.1 布魯菌病在世界各國的疫情

布魯菌病的別稱有弛張熱、波狀熱或者馬耳他熱，當布魯氏菌侵入機體時，會引起人畜共患疾病，流行范圍廣泛，俗稱“懶漢病”。因攜帶有布魯氏菌病的羊、牛、豬等家畜在接觸中將其傳染給人類，因此其在生物接觸中具有傳染性，但目前研究證明發現，布魯菌病在人與人的接觸中不具傳染性。臨床癥狀內容復雜，且不易分類，患病后主要為發熱、多汗、乏力、骨關節和肌肉酸痛，通常情況下，患者發熱可持續15 ～20 d，且反復性強；通過病理學診斷分析，該癥對人體的生殖系統影響效果較為直觀，一旦未能及時得到有效控制，將促使患者生殖能力損傷甚至喪失；同時將引發不同程度的關節、肌肉疼痛，嚴重情況下可直接剝奪患者勞動能力，甚至威脅生命[1]。據世界統計資料顯示，2018 年中國布魯氏菌病發病數量為21735 例，2017 年中國布魯氏菌病發病數為38554 例。而根據中國疾病預防控制中心的資料顯示，布魯菌病的治愈率在近年間雖然得到有效控制，但發病率仍舊處于較高水平[2]。

1.2 布魯菌病的發病機制

雖然布魯菌感染的病癥機理較為復雜，但其本質上屬于傳染性疾病，而傳染源大多數是病菌，病菌從患者的皮膚或者粘膜侵入身體，隨著淋巴液的移動到達淋巴結，進而被吞噬細胞吞噬。因此欲分析其發病機制，需結合患者自身相關免疫功能，布魯菌病的免疫反應功能包括兩種類型，即先天性免疫與適應性免疫，前者通常為非特異性免疫，后者通常為特異性免疫[3]。在形成病灶的過程中，若免疫系統發揮功能，阻斷吞噬細胞，則可有效抑制病情，如果不能殺滅吞噬細胞，會促進細胞內的細菌自由生長繁殖，因而形成局部的原發病灶。在分析布魯菌病的病變過程可以發現，當病菌進入人體后，最先出現的是中性多核粒細胞?；诖耍婊畹牟剪斁鷮㈦S淋巴液到達到局部淋巴結，并在相當一段時間內，不會出現明顯病變，此階段相當于潛伏期[4]。隨著疾病進展，沒有被免疫系統殺滅的病菌被吞噬細胞吞噬，隨著血液的流動帶到全身各處，在人體的肝、脾等臟器內繁殖，當病菌繁殖到一定的數量之后，會沖破淋巴結的屏障，進而侵入人體的血液循環，在這種情況下就會出現毒血癥等相關癥狀，從而形成具有多發性的病灶。此時，如果吞噬細胞的吞噬能力低于患者病灶釋放的細菌時，會出現細菌在細胞外的血液中繁殖并生長，因此出現敗血癥的癥狀。需要注意的是，在不同因素的影響下，如果機體遭受破壞，由患者本身釋放的內毒素等成分不僅會造成菌血癥、敗血癥等癥狀，還會發生毒血癥[5]。因此臨床檢測中，對于內毒素的關注程度相對較高，如果患者感染細菌的量比較大，或者缺失免疫功能，機體中的一部分細菌會避開受到免疫功能的影響，故而這些細菌可能會被吞噬細胞吞噬，然后將其帶入到其他的組織或者器官中，最終形成新的感染灶，此階段在臨床中被稱為多發性病灶階段。因此，在不同組織病理損傷的影響下，布魯菌病的臨床表現通常呈現著多樣化的趨勢。

1.3 布魯菌病的病理分析

根據人體免疫系統的原理可見，先天性免疫系統是抵抗病原菌入侵的第一道防線，其中以巨噬細胞及樹突狀細胞為主，而適應性免疫主要由Th1免疫為主，其能夠有效清除病原體，從而避免病菌進行擴散。相關研究表明，機體在對抗布魯菌時，主要靠CD4+及CD8+T 淋巴細胞、Th1類細胞因子（IFN-γ TNF-α）及活化的巨噬細胞和樹突狀細胞[6]。另一方面，布魯菌建立了很多逃逸固有免疫與適應性免疫應答的機制，因此其傳染途徑較多，且不易被自愈因子發現，因此布魯菌病具有極高的發病率，均源自胞內布式小體達到在宿主胞內長期寄生及復制的目的。巨噬細胞及DCs 吞噬布魯菌的過程中，清除細菌的過程可在數小時完成，而殘留的細菌將進入復制小體[7]?？梢姡剪斁≈饕訲h1型細胞免疫應答為主，在治療的過程中，可通過抑制腫瘤壞死因子的分泌而抑制巨噬細胞凋亡，從而有效弱化其抗原提成功能，達到阻斷抗原特異性T 細胞的識別效果，形成有利于生存和繁殖的微環境。因此，布魯菌的侵犯范圍可達人體內的每一處器官組織，對胞內環境的適應能力極強，所以可側面證實。細菌、病原菌分泌的毒素、免疫抑制、變態反應及內分泌紊亂等現象在布病的發病或在維持疾病狀態中都發揮著重要的作用[8]。

通過以上揭示的布魯菌發病機制，在特異性T細胞免疫應答中，此過程由CTL 細胞參與，而穿孔素及顆粒酶B 在CTL 細胞殺傷病原體方面發揮著重要作用。所以穿孔素及顆粒酶B 在布魯菌病的發生、發展及轉歸中亦起著不可忽視的作用。

2 穿孔素及顆粒酶的簡介

2.1 穿孔素和顆粒酶的一般性質

穿孔素是細胞毒性T 細胞（CTL）和NK 細胞殺傷的主要毒性蛋白（Perforin），又稱孔形成蛋白（PFP），在自身免疫、抗病毒免疫以及抗腫瘤免疫中都有重要的調節作用，是重要的免疫調節及免疫效應分子。單純從生物學方面理解，穿孔素屬于淋巴因子，但因淋巴因子的種類繁多，目前臨床研究已明確機制的淋巴因子種類較少，因此臨床上廣泛認定為淋巴因子的有白細胞介素（約有10 余種）、單核-巨噬細胞移動抑制因子（MIF）、白細胞移動抑制因子（LIF）、單核-巨噬細胞趨化因子（MCF）、白細胞趨化因子（LCF）、B 細胞生長因子（BCGF）、B 細胞分化因子（BCDF）、細胞毒性因子、干擾素等。顆粒酶是外源性的絲氨酸蛋白酶，來自細胞毒淋巴細胞（CTLs）和自然殺傷細胞（NK）釋放的細胞漿顆粒，顆粒酶進入細胞，在其內容物釋放的影響下，將導致細胞凋亡。此類大分子通常在自然殺傷細胞（NK）中表達，它們在CTL 中的表達受幾種細胞因子的調節。其中，已知IL-2、IL-12 都能誘導PFP和顆粒酶mRNA 的大量增加[9]。目前可以確定的是，穿孔素與顆粒酶的效果均是Ca2+十分依賴的，因此在不同的臨床情況下測定顆粒酶與穿孔素均可作為健康與病態的全新提示。

目前臨床研究已經證實，穿孔素是一種細胞毒顆粒，主要寄存在NK 和CTL 細胞漿內，本質上是糖蛋白的一種，功能和結構與C9補體相似，不具特異性識別功能，因穿孔素是天然殺傷細胞與胞毒T 細胞產生，故而天然殺傷細胞屬于非特異性免疫范疇，產生穿孔素只是胞毒T 細胞的功能之一；另外，穿孔素可以使人體細胞破裂也可以使細菌破裂，自然不存在特異性。結合其分子內部信息可見，其通常多個二硫鍵連接，在非還原狀態下，分子量為60 ～65 KD；而在還原狀態下，分子量為70 KD。因此人體一旦發生病毒感染或出現傳染性疾病，機體內有較高的幾率出現病毒感染或腫瘤、移植排斥反應，因此穿孔素的表達也會隨之提升。國內外眾多文獻顯示，經純化的穿孔素能夠快速促使靶細胞發生溶解，但在細胞膜自我修復能力的影響下，其必須與顆粒酶共同作用方能促成大規模靶細胞的凋亡效果。

目前臨床研究已經證實，顆粒酶是一種絲氨酸蛋白酶，廣泛分布于活化的CTL 與NK 細胞胞漿中，截至目前為止，臨床上已發現人體中的顆粒酶種類共3 類，為顆粒酶A、顆粒酶B 與顆粒酶C，而發現鼠的顆粒酶有7 種，即顆粒酶A、B、C、D、E、F、G（GrA、GrB、GrC、GrD、GrE、GrF、GrG）[10]。人體內的顆粒酶基因分子量存在30kD、32kD、35kD 等形式，且同一蛋白帶有不同的輔基，不僅具有門冬氨酸的活性，同時可被Boc-Ala-Ala-Asp-Ch2Cl 抑制。因此，活化后的CTL 在識別靶細胞后，通過顆粒外排的方式，將顆粒酶分泌到細胞間隙，進而對其進行殺傷，在殺傷的同時，CTL 又能夠迅速合成顆粒酶，這些新和成的顆粒酶不僅能夠直接分泌到細胞外，又可以儲存起來，以供殺傷下一個靶細胞[11]。

2.2 顆粒酶和穿孔素的殺傷機制

明確穿孔素與顆粒酶的生物特性后，臨床上已將其廣泛應用于疾病的檢測與分析中，由于二者均存在于前體細胞中，雖然穿孔素的表達水平并不明顯，但是穿孔素在激活NK 和CTL 中卻發揮著關鍵的作用，從而實現提升其表達水平的目的。值得注意的是，一旦CTL、NK 細胞充分融合于靶細胞后，經顆粒胞吐反應，效應細胞釋放致密的胞漿顆粒。同時內容物入靶細胞和效應細胞的結合位點處，靶細胞將受到十分嚴重的攻擊，甚至喪失細胞功能。通過眾多文獻資料可見，其反應過程中將釋放出大量的大分子物質，而其中尤以PFP 和顆粒酶占較大比例[12]。因此，分離、純化的PFP 和GrB 與雙標記的靶細胞，并聯合51Cr 標記靶細胞膜的特性，是有效降低靶細胞損傷有效途徑之一；需滿足靶細胞DNA 被125I-Udr 標記、單用PFP 引起靶細胞膜受損釋放51Cr 等條件，但若出現125I-Udr 釋放，則將促使其損傷延續，加劇疾病反應。而唯有確保靶細胞DNA 連接完整，才能有效保障其反應過程的安全性?；诖?，可推測出，將GrB 單用并不是導致1Cr 釋放的唯一因素，同時也不是導致125I-Udr 釋放的必要原因，其需要在同一時間內滿足PFP、GrB 兩項條件，缺一不可，才能有效檢測出51Cr的釋放，觀察125I-Udr 快速釋放的過程。因此，靶細胞受損的先決條件來自于PFP，而正因為PFB 導致了靶細胞損傷，才能保障后續過程中，GrB 對靶DNA 促成斷裂干擾。不過雖然單純的PFP 無法導致細胞凋亡，但是仍會起到溶解細胞膜的作用，常見于細胞滲透性溶解現象。如果二者同時存在，則需要觀察在靶細胞漿內是否再次分布，同時明確其余細胞核的距離；如果在細胞核中同時存在二者，就會直接導致細胞凋亡。分析《穿孔素和顆粒酶的研究進展》中的內容可見，GrB 一旦進入靶細胞，通過目前尚未知的中介物激活P 34 cdc2，可引起染色體濃縮，DNase激活，DNA被切割，最后發生細胞凋亡（Apoptosis）。其在臨床研究中，通常將其定義為PFP 間接殺傷功能[13]。

3 穿孔素及顆粒酶與布魯菌病發病的關系

通過布魯氏菌效應蛋白及其互作靶標篩選鑒定，解讀胞內轉運、致病作用、免疫逃逸或持續性感染機制發現，布魯菌病患者的免疫抑制過程中，CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、Th1類細胞因子（IFN-γ、TNF-α）及活化的巨噬細胞和樹突狀細胞占據著主要位置。而統計眾多研究文獻資料可見，CD8+CTL 具有良好的保護效果[14]?；罨腃TL 細胞可以通過Fas 途徑，在細胞毒作用和IFN-γ 分泌過程中，激活自身免疫功能，從而抑制布魯氏菌。經臨床資料顯示，慢性化及復發患者的外周血CTLs 細胞數量可見其明顯高于其他類型的患者，從側面即可證實，由于慢性期患者的CD4+T 淋巴細胞存在明顯的功能缺陷，因此導致患者的病情遷延不愈，反復發作。同時，慢性期患者CD4+T 淋巴細胞上的CD152（CTLA-4）表達上調，能夠反映出CD4+T淋巴細胞的損害。基于現有研究的相關數據，CD4+T 淋巴細胞數量起到了決定性作用，如果其水平降低，將導致布魯菌重要免疫反應的增強，從而促使已失去活性的免疫細胞重新工作，并不斷刺激新的免疫細胞誕生，正因如此，在患者疾病發作的過程中，部分患者會從急性期感染癥狀自然過渡至慢性期感染，在一定程度上，屬于典型的免疫抑制效果[15-16]。

綜上所述，在布魯菌病患者的病變感染過程中，在證實外周血白細胞被激活，而細胞毒性淋巴細胞（CTL）接觸靶細胞后的情況下，可充分利用穿孔素與顆粒酶生物特性，促使其進入細胞間隙中，在Ca2+的存在下迅速附著于靶細胞膜中，并在其中開拓不同孔道的跨膜通路，完全作用于雙層磷脂中，進而促使顆粒酶A、B 等能夠完全進入細胞漿與細胞核中，對病毒細胞的DNA 產生阻斷效果，從而促成布魯氏病菌凋亡。

4 展望

布魯氏菌屬內種型繁多，各種型間毒力強度、生物型性狀、宿主傾向性、流行特征等方面各不相同。雖然關于此病的研究已有較長的時間，但是在該病的相關領域仍存在較多的問題，而且關于此病的治療方面，結果仍不理想，因此，在臨床中需要進一步明確布魯菌病的發病機制，充分利用穿孔素與顆粒酶的生物特性，加強二者在布魯氏菌的分型和病原學檢測中的應用，深入研究布魯氏菌的流行病學特征，繼而提升對布魯氏菌病的治療效果，以期為布魯菌病患者帶來更多福音。