膽囊癌組織多個腫瘤相關基因甲基化的檢測及其意義

孔雷，徐瑞云，吳慶華，李能平，秦建民，楊華麗

（1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院 普外科，上海 201821；2.上海東方肝膽外科醫院安亭新院 普外科，上海 201805；3.上海市第四人民醫院 超聲科，上海 200081）

膽囊癌（gallbladder cancer，GC）是膽道惡性腫瘤中一種主要類型，約占膽道惡性腫瘤的1/2左右。GC的臨床特點是惡性度高、預后很差，確診時大多數病例處于晚期。早期發現、手術治療是GC的有效治療手段，放化療等均無明顯療效。GC的發病機制尚不明確，膽囊結石、腺瘤、膽囊腺肌癥等與GC的發病密切相關[1]。GC的臨床診斷多借助于影像學檢查，還沒有一種簡便可靠的特異性的腫瘤學標記物可以應用[2-4]。研究表明，甲基化修飾是一種表觀遺傳學的修飾方式，腫瘤相關基因異常甲基化，特別是抑癌基因，在腫瘤的發生、進展中起重要作用。相比其他胃腸道腫瘤甲基化研究，膽囊癌的相關報道相對較少[4]。本研究通過檢測多個腫瘤相關基因在膽囊癌中的甲基化狀態，分析其與臨床病理學特征的關系，探討基因異常甲基化在GC發病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象及組織標本

選取2014年1月至2017年12月上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院普外科行GC切除術患者的組織學標本。21例GC患者，其中男8例，女13例；平均年齡（59.6±7.1）歲（41～78歲）。Nevin分期：I期1例，II期2例，III期6例，IV期7例，V期5例。病理分級：中低分化19例，高分化2例。組織學分型：腺癌15例，鱗癌2例，腺鱗癌4例；淋巴結轉移12例。另外隨機選取同期20例慢性膽囊炎標本作為對照組，其中男8例，女12例；平均年齡（55.1±8.5）歲（36～81歲）。兩組患者的性別、年齡等一般情況相比較，差異均無統計學意義（表1）。所有組織標本取材后立即放入液氮中保存，隨后置入-80 ℃冰箱保存。另取部分組織進行病理學檢查。

1.2 方法

1.2.1 膽囊組織基因組DNA提取、甲基化水平檢測：采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取膽囊組織基因組DNA。UV 3000紫外分光光度儀檢測基因組DNA濃度和純度。使用Methylamp Global DNA Methylation Quantification Ulrta Kit試劑盒檢測基因組總甲基化水平。根據說明書要求，純化的200 ng組織DNA經過孵育、漂洗后，甲基化的DNA與其特異性的抗體結合后，采用BIO-RAD680酶標儀讀取樣本在450 nm處的吸光度值并計算基因組甲基化水平。

1.2.2 膽囊組織基因組DNA亞硫酸鹽修飾：紫外分光光度儀檢測基因組DNA濃度和純度后，OD260/OD280比值處于1.8～2.0之間的樣本DNA用于甲基化修飾。采用Intergen CpGenome DNA modification kit甲基化修飾試劑盒進行基因組DNA亞硫酸鹽修飾。DNA經過NaOH變性、亞硫酸鹽修飾、50 ℃水浴避光過夜。經過修飾后的基因組DNA，甲基化的胞嘧啶保持不變；而未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，在PCR反應中擴增為T，而5-mC不變。根據說明書要求，取基因組DNA 500 ng，用PCR級去離子水稀釋至20 μL，然后加入130 μL CT轉化劑，經過孵育、脫硫、洗脫等步驟后，亞硫酸鹽修飾后的基因組DNA置于-80 ℃冰箱保存，用于甲基化特異性PCR反應。

1.2.3 甲基化特異性PCR（MSP）檢測：針對細胞周期依賴性蛋白激酶抑制基因P16、細胞周期依賴性蛋白激酶抑制基因P15、人DNA錯配修復蛋白基因（hMLH1）、APC基因、PTEN基因和RUNX3基因啟動子轉錄調控區域設計PCR引物。分別采用甲基化和非甲基化引物進行PCR擴增。甲基化特異性PCR反應體系為25 μL，包括修飾完畢的基因組DNA 2 μL、上下游引物各1 μL、1×PCR buffer II（Perkin-Elmer）、1 IU AmpliTaq Gold polymerase （Perkin-Elmer）、2 mmol/L MgCl、0.25 mmol/L Dntp。MSP循環條件：95 ℃預變性10 min，然后95 ℃變性30 s，特定溫度退火45 s，72 ℃延伸45 s，最后72 ℃延伸7 min，共40個擴增循環。為了保證實驗結果的可靠性，體外甲基化DNA（in vitro methylated DNA，Intergen）作為陽性對照，不含DNA的蒸餾水作為陰性對照。反應結束后取10 μL PCR產物，利用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色，于紫外燈下觀察分析結果。為確保結果的準確性，所有實驗均重復檢測。

1.3 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件包進行統計學處理，計數資料兩組間的比較采用χ2檢驗，P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 基因甲基化與臨床病理特征的關系

6個基因的甲基化狀態與患者的性別、年齡、組織學類型、病理分級及Nevin分期均無相關性（P＞0.05） （表1）。P16基因的甲基化狀態與淋巴結轉移有相關性（P＜ 0.05），其余五個基因與淋巴結轉移無相關性（表1）。

表1 膽囊癌組織異常甲基化與臨床病理特征的關系 （例）

2.2 膽囊癌組織和慢性膽囊炎組織基因組總甲基化水平檢測結果

GC組織基因組總甲基化水平[（4.1±0.8）%]明顯低于慢性膽囊炎基因組總甲基化水平[（6.8±1.2）%]，差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。

2.3 甲基化特異性PCR（MSP）檢測結果

檢測結果顯示，在21例膽囊癌組織中，均存在異常甲基化狀態，其中2例（9.5%）為1個基因甲基化，8例（38.1%）為2個基因同時存在甲基化，6例（28.6%）為3個基因同時存在甲基化，3例（14.3%）為4個基因同時存在甲基化，2例（9.5%）為5個基因同時存在甲基化。

圖1 膽囊癌組織基因甲基化特異性PCR產物電泳分析

在6個基因中，GC組織甲基化率較高的3個基因APC、P16和RUNX3分別為14例（66.7%）、12例（57.1%）和11例（52.4%） （電泳結果，圖1），明顯高于另外3個基因P15、PTEN和hMLH1在GC組織中的甲基化率分別為8例（38.1%）、7例（33.3%）和6例（28.6%）（P＜ 0.05）。20例慢性膽囊炎組織僅有2例發生單個且均為不同基因（分別為P15和PTEN基因）的甲基化。GC組與慢性膽囊炎組兩者之間甲基化率具有明顯差異（P＜ 0.05）。

3 討論

DNA異常甲基化包括基因組整體的低甲基化以及特定區域的高甲基化，前者引發基因突變頻率增加；后者可破壞基因組正常的甲基化程序、干擾基因正常表達，導致細胞增值失控，促進腫瘤的發生發展。在臨床上，GC一經診斷絕大多數患者處于晚期，預后極差。相比肝癌和胃腸道腫瘤，GC還沒有一種特異性的和針對性的腫瘤學標記物可以應用于GC的診斷和治療[5]。DNA的異常甲基化通常發生在腫瘤顯著惡性表型出現之前，故其檢驗可預測腫瘤的發生，具有臨床應用價值[6]。

在基因組整體低甲基化狀態下，通過5-mC的自發性脫氨和增加外來致癌物的親和力等方式，導致基因不穩定、突變頻率增加。在其他實體性腫瘤中，基因組總甲基化水平降低是普遍現象。本研究顯示，GC的基因組總甲基化水平顯著低于慢性膽囊炎，與前述結論一致。因此，有學者建議把基因組的總甲基化水平作為一種生物學標記物用于腫瘤的篩查和預后判斷[7-9]。

初期的GC甲基化研究局限于單個抑癌基因的異常甲基化，如P16、PTEN、APC等[10-12]。Ueki等[13]報道中國人群P16基因異常甲基化率為14.8%（8/54）。Tozawa等[14]報道日本人群P16基因異常甲基化率為22.2%（2/9）。然而，另有學者報道P16基因異常甲基化率為56%[15]。在本研究中P16基因的甲基化率為57.1%，這表明，在GC甲基化研究中，即使同一種基因，不同學者報道的甲基化率也存在顯著差異。隨著研究的深入，單個基因的研究無法準確、全面的分析甲基化在GC發病機制中的作用。學者們發現多基因的聯合檢測相對于單基因的檢測，可以明顯提高檢測的特異性和敏感性[16]。Hanse等[17]在膽道腫瘤組織中發現了多種異常表達的基因，開啟了GC的多基因研究。Takahashi等[18]研究了24種抑癌基因在GC和慢性膽囊炎患者膽囊組織中異常甲基化情況，在GC患者中表現為高甲基化率的前6位的基因依次為：SHP1（80%）、3-OST-2（72%）、CDH13（44%）、P15 INK4B（44%）、CDH1（38%）、RUNX3（32%），GC組平均甲基化指數明顯高于慢性膽囊炎組。該研究提示抑癌基因的異常甲基化是GC發病機制中的一個早期事件，而且存在多個基因的異常甲基化。

我們參考文獻中有關膽囊癌基因甲基化率的報道，選擇了APC等六個基因作為研究對象，這六個基因均與消化系腫瘤密切相關[13，15，18]。其中，APC基因是重要的Wnt信號途徑抑制因子，異常甲基化的APC基因會導致啟動增殖的相關基因的異常轉錄；P16基因調控細胞周期，調節細胞的分裂和增值。在本研究中，21例GC患者中，有19例（90.5%）GC可以檢測到至少2個以上基因的甲基化。在6個基因中，APC、P16和RUNX3三種基因的甲基化率相對較高，推測該3種基因的甲基化所導致的基因失活促進了GC的發生與進展。6個基因的甲基化狀態與患者的性別、年齡、組織學類型以及病理學分期等臨床特征均無相關性。但是，P16基因的甲基化狀態與淋巴結轉移有顯著相關性，而其余五個基因無相關性。在文獻中，關于基因異常甲基化與膽囊癌的組織學類型、病理分期、淋巴結轉移等是否相關還存在較大差異。House等[15]報道了6種候選抑癌基因在GC中的異常甲基化率高達72%，最高的前3種基因分別是P16、P73、APC；異常甲基化存在國家地域之間的區別，提示多個基因異常甲基化在GC中是一個普遍、頻繁的事件。在文獻報道中，同一種抑癌基因以及多種抑癌基因甲基化率存在較多差別，究其原因，與檢測方法的靈敏性、準確性有關，與GC的病理學類型、臨床分期有關，同時也與種族差異、人群分布密切相關[19]。我們認為探討甲基化與GC臨床特征的關系還需要更大的臨床樣本、更多的相關基因及多中心研究。

總之，在表觀基因組水平制定GC完整的DNA異常甲基化變化圖譜并提供高效的腫瘤相關基因來檢測GC，探索其表觀遺傳學機制，同時將甲基化與基因沉默途徑、基因印記、性別、年齡、病理學類型及分期等綜合分析，是進一步努力的方向。