基于代謝組學(xué)的生脈注射液治療膿毒癥作用機(jī)制研究※

柴瑞平 張晏航 路 娟 王同瑾 陳 曦*

膿毒癥是一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，通常由微生物感染引起[1]。膿毒癥患者體內(nèi)的大量炎癥因子，如腫瘤壞死因子-a（TNF-a）、白細(xì)胞介素-1b（IL-1b）和白細(xì)胞介素-6（IL-6），可導(dǎo)致嚴(yán)重全身炎癥反應(yīng)發(fā)生，引發(fā)多器官功能障礙[2]。目前，治療膿毒癥的關(guān)鍵是有效快速控制炎癥反應(yīng)，臨床常用治療藥物為糖皮質(zhì)激素和抗生素。然而，這些治療方法僅可緩解癥狀，并不能根治，且易出現(xiàn)不良反應(yīng)。中醫(yī)藥用于治療疾病已有2000多年歷史，并且早在現(xiàn)代西醫(yī)發(fā)明前就為中國(guó)人提供了可靠的醫(yī)療保健[3]。中醫(yī)提倡組合治療策略，不同種類中草藥配方可提高療效和減少毒性[4]。

生脈注射液由紅參、麥冬、五味子三味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、復(fù)脈固脫功效，適應(yīng)證為氣陰兩虧、脈虛欲脫的心悸、氣短、四肢厥冷、汗出、脈欲絕，用于治療具有上述證候的疾病心肌梗死、心源性休克、感染性休克等。近年來(lái)一些研究證明，采用生脈注射液治療膿毒癥臨床療效顯著[5-8]。但基于中醫(yī)藥通常通過(guò)協(xié)同作用發(fā)揮作用，反映一種整體的動(dòng)態(tài)效應(yīng)，因此在生脈注射液治療膿毒癥的研究中只關(guān)注一點(diǎn)是不合適的。選擇一種與中醫(yī)藥整體理念一致的方法深入探討生脈注射液治療膿毒癥的機(jī)制十分必要。

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的下游領(lǐng)域，是基于藥物治療的全球代謝物譜來(lái)探索生物系統(tǒng)功能的一種集成技術(shù)。代謝組學(xué)主要著眼于整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)，而非單個(gè)代謝物，其與中醫(yī)的協(xié)同作用特性高度吻合，尤其適用于中藥作用機(jī)制研究。因此，代謝組學(xué)已成為評(píng)價(jià)中醫(yī)藥治療復(fù)雜疾病療效及機(jī)制的重要手段。考慮到生物樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，檢測(cè)儀器將是影響代謝組學(xué)分析結(jié)果的重要因素。新型軌道器高分辨率質(zhì)譜分析平臺(tái)具有較高的質(zhì)量分辨率和質(zhì)量精度、更寬的動(dòng)態(tài)范圍和較好的靈敏度，可以為復(fù)雜生物和中藥樣品的代謝組學(xué)研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。本研究就基于高效液相色譜-四極/軌道高分辨質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)方法探討生脈注射液治療膿毒癥的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

TripleTOF 5600+LC/MS/MS系統(tǒng)（美國(guó) AB SCIEX公司）；ML-T分析天平（瑞士梅特勒-托利多）；VDUPL超純水機(jī)（九方沃德科技有限公司）；生脈注射液（江蘇蘇中生物制藥有限公司，批號(hào)：20170841）；水合氯醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

1.2 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠24只，體重為（200±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心提供。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前大鼠在動(dòng)物室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)將其分為空白組、模型組、生脈注射液組，每組8只。

1.3 模型復(fù)制、給藥及代謝樣本制備

采用國(guó)際公認(rèn)的盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥動(dòng)物模型。方法如下：術(shù)前禁食 12 h，于大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）麻醉，備皮、碘仿消毒腹部，于下腹正中做一2 cm切口，暴露盲腸。于盲腸遠(yuǎn)端1/2處用無(wú)菌4號(hào)絲線結(jié)扎，用無(wú)菌中號(hào)圓針帶7號(hào)絲線縫穿結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端，并將7號(hào)絲線雙股打結(jié)，留直徑約2 cm線環(huán)。采用1 ml注射器向已結(jié)扎的盲腸遠(yuǎn)端注射0.9%氯化鈉注射液0.5 ml，分 2層關(guān)腹，制成膿毒癥大鼠模型，觀察大鼠的一般形態(tài)學(xué)變化。治療組造模后腹腔注射生脈注射液2 ml/kg[9]，其余組予以等量0.9%氯化鈉注射液干預(yù)。收集12 h夜尿，于4℃下以每分鐘10 000rpm離心20 min，取尿液上清液置于EP管中，于-80℃下保存，代謝組學(xué)分析樣本取原尿液，在上述條件下離心后過(guò)0.22 μm濾膜作為代謝物供試品溶液。

1.4 代謝組學(xué)分析條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTM C18column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水，流動(dòng)相C為10%乙腈、90%異丙醇、0.1%甲酸、10 mM甲酸銨；柱溫：45℃；樣品倉(cāng)溫度：4℃；流速：0.4 ml/min；進(jìn)樣體積：2 μl；色譜儀流出液不經(jīng)分流直接注入質(zhì)譜儀進(jìn)行正負(fù)離子掃描分析。見(jiàn)表1。

1.5 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理

表1 膿毒癥大鼠尿液流動(dòng)相梯度洗脫方法

代謝數(shù)據(jù)采用組學(xué)最新分析平臺(tái) ProgenisisQI 1.0 2.0（Waters公司，美國(guó)）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理過(guò)程，采用EZinfo 2.0（Waters公司，美國(guó)）對(duì)代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別分析，通過(guò)偏最小二乘判別分析OPLS-DA模塊中的重要變量投影值VIP的大小篩選膿毒癥代謝異常的小分子代謝產(chǎn)物作用膿毒癥的尿液潛在生物標(biāo)記物。最后通過(guò)國(guó)際權(quán)威代謝物組數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB收錄的代謝物二級(jí)質(zhì)譜圖與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，鑒定生物標(biāo)記物。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

空白組大鼠動(dòng)作敏捷，皮毛光澤、密集，精神狀態(tài)良好，二便正常。模型組大鼠活動(dòng)減少、食欲明顯減少、體溫明顯降低、體重減輕、反應(yīng)遲緩、拱背聳毛、毛色無(wú)光澤、有脫毛現(xiàn)象，6 h后出現(xiàn)腹瀉等癥狀，24 h后出現(xiàn)呼吸急促、動(dòng)作緩慢等現(xiàn)象。生脈注射液組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)方面與模型組比較明顯改善。

2.2 代謝組學(xué)

通過(guò)聚焦影響代謝分布異常的小分子代謝產(chǎn)物，通過(guò)與人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的代謝物二級(jí)圖譜比對(duì)鑒定代謝物，分別是脯氨酸、L-蛋氨酸、亮氨酸、亞精酸、牛磺酸，見(jiàn)表2。本部分基于TripleTOF 5600+LC/MS/MS系統(tǒng)的高分辨質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)對(duì)膿毒癥大鼠尿液進(jìn)行代謝輪廓分析，見(jiàn)圖1。通過(guò)設(shè)定荷質(zhì)比掃面范圍50～1000 m/z全掃描尿液代謝數(shù)據(jù)。如圖2所示，尿液代謝輪廓顯示空白組和模型組大鼠的代謝分布明顯分離，生脈注射液組處于兩組間，且與空白組距離較近，表明采用生脈注射液治療膿毒癥大鼠臨床療效顯著。如圖3所示，通過(guò)對(duì)通路富集分析發(fā)現(xiàn)膿毒癥大鼠代謝主要涉及牛磺酸和亞牛磺酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝。最后通過(guò)可視化軟件構(gòu)建代謝通路示意圖（圖4）。

表2 膿毒癥大鼠尿液生物標(biāo)志物分析

圖1 空白組、模型組及生脈注射液組正負(fù)離子模式下代謝輪廓圖

圖2 空白組、模型組及生脈注射液組的主成分分析得分圖

圖3 膿毒癥大鼠尿液代謝通路富集分析

圖4 膿毒癥大鼠模型尿液代謝通路圖

3 討論

氨基酸代謝異常在消耗性疾病中，如膿毒癥中普遍存在。本研究中涉及氨基酸代謝紊亂途徑主要包括纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等。相關(guān)生理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)發(fā)生膿毒癥后，機(jī)體將經(jīng)歷高能量和高代謝狀態(tài)[10]。作為能量的儲(chǔ)存單位，氨基酸（如脯氨酸、蛋氨酸和亮氨酸）在膿毒癥中將經(jīng)歷過(guò)度消耗，并且水平可能急劇下降。雖然氨基酸的降解在維持能量平衡中發(fā)揮著重要作用，也反映了機(jī)體的自動(dòng)補(bǔ)償機(jī)制，但是其可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平增加，從而惡化病情。而生脈注射液組情況有所好轉(zhuǎn)，氨基酸水平升高可穩(wěn)定代謝途徑，同時(shí)減輕組織損傷。這種現(xiàn)象可能是由于生脈注射液中的葡萄糖可能被優(yōu)先氧化以提供能量，使氨基酸消耗減少，血漿水平顯著升高，最終氨基酸代謝開(kāi)始逐漸恢復(fù)正常。

代謝通路分析發(fā)現(xiàn)牛磺酸與低氧代謝密切相關(guān)。牛磺酸是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的游離氨基酸，在維持鈣穩(wěn)態(tài)、膽汁酸結(jié)合狀態(tài)和膜穩(wěn)定等重要生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。氧化應(yīng)激與炎癥高度相關(guān)，在各種病理?xiàng)l件下同時(shí)出現(xiàn)并相互作用。而牛磺酸具有明顯的抗氧化和抗炎作用，能明顯改善膿毒癥大鼠模型的炎癥程度。減少牛磺酸的主要機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)流、過(guò)度消耗和缺乏合成底物。但注射生脈注射液后膿毒癥大鼠的牛磺酸水平顯著升高，炎癥細(xì)胞因子水平顯著下降。通過(guò)對(duì)生脈注射液中的成分分析發(fā)現(xiàn)，丹參中的丹酚酸和赤芍中的沒(méi)食子酸均具有良好的抗氧化作用。在藥物活性成分的協(xié)同作用下，牛磺酸能最大限度地發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，且在膿毒癥中自耗程度較低。

精氨酸雖然不是必需氨基酸，但在嚴(yán)重應(yīng)激情況下（如膿毒癥）、或當(dāng)缺乏精氨酸便不能維持氮平衡與正常生理功能，因此其稱為條件性必需氨基酸。精氨酸缺乏可引起機(jī)體微循環(huán)功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者組織及血液中的精氨酸水平較健康人群及非膿毒癥患者低，攝入減少、內(nèi)源性精氨酸生成減少以及分解代謝增加等是膿毒癥患者體內(nèi)精氨酸水平降低的重要原因[11]。補(bǔ)充外源性精氨酸能夠降低膿毒癥患者的感染發(fā)生率，縮短住院時(shí)間。

本研究基于經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔法誘導(dǎo)大鼠膿毒癥，對(duì)重要生物學(xué)相關(guān)代謝變化及生脈注射液的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。本研究表明 TripleTOF 5600+LC/MS/MS代謝組學(xué)研究為闡明生脈注射液對(duì)膿毒癥模型大鼠的能量供應(yīng)、抗氧化、抗炎作用及探討該藥物對(duì)膿毒癥患者的治療機(jī)制提供了科學(xué)有力的工具。在臨床上進(jìn)一步加深對(duì)中藥藥理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)中醫(yī)藥理作用機(jī)制。