當歸中不同部位有效化學成分分析

蘇丙賀

當歸為傘形科植物當歸的根部，別名云歸、岷歸、西歸等，其性溫，味甘辛，具有補血活血、止痛調經及潤燥通便等功效。作為補血要藥，當歸具有“氣厚味薄，可升可降”（出自《主治秘訣》）的特點，常見于多種類型的遣藥組方中，其藥用價值趨向于多樣化，正所謂“十方九歸”。古代醫家認為當歸的不同部位具有不同藥理學作用，整個略呈圓柱形的全當歸根部分為四部分：全歸、歸頭、歸身以及歸尾。明代的《本草通玄》云“頭止血而上行，梢破血而下行，身養血而守中，全活血而不定”。目前從當歸中分離、提取出的有效化學成分已有 160余種[1]，體現了當歸藥用價值的多樣性。本研究從當歸揮發油、阿魏酸及總鞣質三個方面，擬比較全歸、歸頭、歸身及歸尾的有效成分，為中醫辨證治療使用當歸不同藥用部位提供可靠依據。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司，型號：1100）；電子分析天平（賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，型號：LA-230S）；超純水系統（Millipore公司，型號：Milli-Q）；紫外分光光度儀（Beckman公司，型號：DU-640）；調溫型電熱套（廣州新興電器廠，型號：MO-2）；混勻器（江蘇新康醫療器械有限公司，型號：XK-96）；電熱恒溫水浴鍋（黃驊市渤海電器廠，型號：DZKW-4）。

1.2 實驗用藥

本實驗所采用當歸均為甘肅省岷縣的道地藥材，于入秋后隨機采挖，洗凈、去雜質后，將當歸分別進行全歸、歸頭、歸身以及歸尾的處理，再做成切片陰干。4種樣品均由本溪市紅十字會醫院中藥局多名藥學教授鑒定，其鑒定結果符合 2010年《中華人民共和國藥典》中當歸性狀、炮制的標準。阿魏酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：0773-9910），沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-200802），水為經Millipore超純水器所得的超純水，甲醇（色譜純），其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 揮發油的含量與成分測定

2.1.1 揮發油的含量測定參照《中華人民共和國藥典》（2010年版）一部中附錄XD項下乙法測定，精密稱取當歸各部位樣品200 g，置于2000 ml燒瓶中，加水 500 ml，將揮發油測定器以及回流冷凝管與之連接，緩緩加熱至液體微沸，并保持微沸狀態5～8 h，停止加熱后靜置1 h，讀取各樣品中揮發油體積，并計算揮發油含量，見表1。

2.1.2 揮發油成分測定本實驗應用氣相色譜-質譜聯用法測定揮發油，來分析當歸各個藥用部位中揮發油的主要成分。氣相色譜條件：進樣口溫度為250 ℃；載氣：He；分流：無；進樣量：2.0 μl；程序升溫：初始溫度為40 ℃，2 min后以每分鐘升溫3℃速度至150 ℃，保留10 min后再次以每分鐘升溫4 ℃至220 ℃，保留8 min后繼續以同樣速度升溫，直至250 ℃再保留1 min。質譜條件：接口溫度為280 ℃；離子源溫度為 230 ℃；離子化方程式為 EI+；電子能量為70 eV；掃描范圍為30～500 m/z。

通過對 4組當歸不同部位的揮發油成分測定發現，其主要化學成分均為藁本內酯[2]。本研究應用色譜峰面積歸一化法來分析當歸各個藥用部位揮發油中藁本內酯相對含量，結果如圖1。

圖1 當歸各個藥用部位揮發油中藁本內酯含量比較

2.2 阿魏酸含量測定

2.2.1 色譜條件Inertsil ODS-3 C18反相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶0.5%冰醋酸=35∶65；流速：0.8 m/min；檢測波長：322 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μl[3]。

2.2.2 對照品溶液制備應用電子分析天平適量精密稱取阿魏酸對照品，置于20 ml棕色量瓶中，加入70%甲醇溶液，用流動相定容至刻度搖勻，配置成阿魏酸甲醇對照品溶液（0.02 g/L）。

2.2.3 供試品溶液制備將全歸、歸頭、歸身及歸尾切片粉碎，分別精密稱取0.2 g粉末（過三號篩）后，置于具塞錐形瓶中，再精密加入 70%甲醇溶液20 ml，密塞后稱定質量，加熱回流半小時，冷卻后再稱定質量，減失重量以70%甲醇溶液補足，搖勻，靜置，取上清液用0.25 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得4組供試品溶液。

2.2.4 標準曲線繪制用電子分析天平精密量取阿魏酸對照溶液適量，用流動相配成濃度為 0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 g/L的系列對照溶液，按照2.2.1項色譜測定條件，X軸作為橫坐標，表示阿魏酸的濃度，Y軸作為縱坐標，表示峰面積，繪制標準線性曲線后，回歸方程：Y=496 602X+5137.2（r=0.994，P＜0.05），線性范圍為 0.001～0.306 g/L，濃度范圍內線性關系良好。

2.2.5 精密度測試分別精密吸取上述各組供試品溶液10 μl，在上述色譜條件下，重復測定5次，根據阿魏酸峰面積來計算相對標準偏差（RSD）值，阿魏酸的平均精密度 RSD＝1.57%，表明本實驗所制取的供試品溶液中，阿魏酸的精密度符合含量測定要求。

2.2.6 穩定性試驗分別精密吸取10 μl各組供試品溶液，按照上述色譜條件于1 d內，連續進樣6次，根據測定出的阿魏酸峰面積，計算RSD＝1.68%，表明24 h內本實驗中的阿魏酸基本穩定。

2.2.7 重復性試驗按照供試品溶液制備的過程和方法，將完整的全當歸平行制成5份全歸供試品溶液，按上述色譜條件來測定其峰面積，阿魏酸 RSD＝1.18%。

2.2.8 加樣回收率試驗精密稱取全歸樣品 6份，精密加入1 ml阿魏酸對照溶液，按照供試品溶液制備過程和方法進行處理，通過上述色譜條件進行測定，阿魏酸的平均回收率為98.48%，RSD＝2.15%。

2.2.9 樣品的測定分別精密吸取等量的各組供試品溶液及對照溶液，采用高效液相色譜儀測定各組阿魏酸的峰面積，計算其含量，見表1。

2.3 總鞣質含量測定

本實驗測定總鞣質含量采用《中華人民共和國藥典》（2010版）一部附錄XB項下鞣質含量測定法。

2.3.1 對照溶液制備應用電子分析天平精密稱取50 mg沒食子酸置于100 ml棕色量瓶中，加超純水稀釋至刻度后，從中精密量取10 ml該溶液置于50 ml棕色量瓶中，再次加水稀釋至刻度處，搖勻。

2.3.2 供試品溶液制備將實驗用全歸、歸頭、歸身及歸尾切片粉碎，每組樣品分別精密稱取0.5 g粉末（過四號篩）后，置于250 ml棕色量瓶中，加入水150 ml，12 h后超聲處理10 min，待冷卻后再次加水稀釋至刻度，搖勻靜置；沉淀后去掉50 ml初濾液，從續濾液中精密吸取20 ml置于100 ml棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.3.3 標準曲線繪制從對照品溶液中精密吸取0.5 ml、1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml及 5.0 ml置于25 ml棕色量瓶中，分別加入1 ml磷鉬鎢酸試液后，加水至12 ml；最后加入濃度為29%的Na2CO3溶液，稀釋至刻度，搖勻靜置 30 min。以相應試劑為對照組，采用檢測到的最大吸收波長760 nm處測定其吸光度（A），X軸作為橫坐標，表示質量濃度；Y軸作為縱坐標，表示吸光度（A）。繪制標準線性曲線后，得回歸方程：Y=128.50X+0.0693（r=0.978，P＜0.05），線性范圍0.0031～0.15 g/L，濃度范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗精密吸取1 ml沒食子酸對照溶液，按照2.2.5項流程和方法，連續6次測其吸光度（A），結果RSD=0.64%，表明儀器的精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗分別精密吸取上述各組供試品溶液10 μl，用上述方法顯色，在檢測最大吸收波長760 nm處重復測定其吸光度（A）6次，每次測定的間隔為10 min，結果供試品溶液的平均精密度RSD＝2.59%，表明本實驗所制取的供試品溶液在顯色后1 h內穩定。

2.3.6 重復性試驗按照供試品溶液制備過程和方法，將完整的全當歸平行的制成 5份全歸供試品溶液，按上述方法測定總鞣質的含量，RSD＝2.71%，表明該方法的重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗精密稱取實驗用全歸樣品6份（0.5 g/份），精密加入適量沒食子酸對照溶液，按照上述供試品溶液制備歷程進行處理，平均回收率為98.63%，RSD＝2.64%。

2.3.8 樣品的測定分別精密吸取2 ml各組供試品溶液及對照溶液置于為25 ml棕色量瓶中，用上述方法測定吸光率（A），計算總多酚含量；精密吸取25 ml各組供試溶液，加入適量干酪素吸附后，在應用上述方法測定吸光率（A），計算總多酚中不會被吸附的物質含量；鞣質總含量=多酚總含量減去不被干酪素吸附的物質含量，見表1。

表1 當歸不同藥用部位有效成分含量比較(%)

3 討論

歷代醫家根據中醫藥傳統理論和臨床實踐經驗總結出當歸的不同藥用部位具有不同的功效和主治，除全當歸，當歸頭、當歸身、當歸尾均可分別入藥。元代的《湯液本草》有當歸“頭止血，身和血，梢破血”之說。在納入研究的96 593首含當歸的方劑中，收錄“當歸頭”的方劑共30首，關于“當歸身”的方劑有1011首，應用了“當歸尾”的方劑有738首，而“全歸/當歸”的方劑有7717首[4]。藥理學研究發現，當歸不同部位的粉末顏色不同，其含有的有效化學成分含量亦不相同[5]。

當歸中的有效化學成分以揮發油、阿魏酸、當歸多糖及總鞣質等為主[6]。吳國泰等[7]研究發現，當歸揮發油能抑制小鼠主動脈平滑肌收縮，起到降壓作用；當歸所含的阿魏酸能改善血液流變性，抑制血小板聚集[8]。本研究中歸尾所含揮發油及阿魏酸含量最高，因此歸尾抗血小板聚集、抑制平滑肌收縮作用可能強于其他部位。在補陽還五湯（《醫林錯改》）中應用當歸尾，取其活血通絡而不傷血之功效，與川芎、紅花等同用以活血化瘀，這將傳統經驗用藥與本研究的實驗結果相聯系；歸身中揮發油及阿魏酸含量僅次于歸尾，其西醫藥理作用更加溫和，滋補肺腎之百合固金湯中應用歸身，取其養血和血之功效，與本研究結果亦能對應；當歸總鞣質能夠起到收斂止血、抗氧化等作用[9]，本研究歸頭中總鞣質含量最高，這與《本草通玄》中“頭止血而上行”相一致。

本研究中，歸身和歸尾中揮發油所占比例分別為0.826%和0.903%；阿魏酸在當歸不同藥用部位的含量為歸尾＞歸身＞全歸＞歸頭，均符合《中華人民共和國藥典》中規定的含量限度（不得少于0.05%）；總鞣質在歸頭中含量高達0.12%。以上研究結果表明，當歸不同藥用部位中有效化學成分含量具有一定差異。其中歸身和歸頭中揮發油含量最高，歸尾中阿魏酸含量最高，歸頭中總鞣質含量最高，這與其他相關研究結果相似[5]。值得注意的是，目前當歸不同部位的切制得率不相同，與切制比率、切制手法相關，可能會影響當歸各個藥用部分中有效化學成分含量。另外，Fang等[10]運用氣相色譜-質譜在不同溫度下對人血漿代謝物進行加熱，研究表明暴露在高溫情況下，小分子代謝物會發生降解和轉化?；谌梭w血漿代謝物與藥物有效化學成分性質的不同，當歸各部分在應用氣相色譜-質譜聯用法檢測揮發油含量時，其有效成分亦可能在高溫環境下發生轉化或對結果造成影響。本研究下一步將探討當歸不同切制率對其不同藥用部位有效化學成分含量的影響及成分提取方法的影響，以為臨床應用當歸提供理論依據。