平菇菌糠中多糖提取及超氧化物歧化酶檢測研究

姜明 候安妮 畢銘鈺

摘要：利用平菇菌糠為原料，通過單因素試驗分析，對提取多糖的條件進行優(yōu)化，得到最佳提取條件為溫度100 ℃，浸泡時間0.5 h，提取時間1.5 h，料液比1∶15，此時菌糠中多糖提取率最高;在此條件下提取，平菇菌糠中的的多糖含量為5.48%;利用清除羥基自由基法對菌糠多糖進行抗氧化性研究，結(jié)果顯示平菇菌糠在多糖濃度0.1 g/L時清除羥基自由基效果為17.77%，與同等濃度下維生素C的抗氧化性相差不大。通過熱變性、丙酮沉淀的方法對平菇菌糠中的SOD提取及其含量測定進行研究，再利用鄰苯三酚自氧化法測定SOD的活性，發(fā)現(xiàn)平菇菌糠中SOD含量為25.119 μg，酶活為22.28 U/mL。

關(guān)鍵詞：平菇菌糠;多糖;SOD

中圖分類號：F326.5 ? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0194-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.047 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Extraction of polysaccharide from mushroom chaff of

Pleurotus ostreatus and detection of SOD enzyme

JIANG Ming，HOU An-ni，BI Ming-yu

（College of Life Science and Technology，Mudanjiang Normal University，Mudanjiang 157012，Heilongjiang，China）

Abstract： Using Pleurotus ostreatus fungus bran as raw material， the conditions for extracting polysaccharides were optimized through single-factor test analysis. The optimal extraction conditions were temperature 100 ℃， soaking time 0.5 h， extraction time 1.5 h， and the ratio of material to liquid was 1∶15， under which the extraction rate of polysaccharides from fungus bran was the highest; and the polysaccharide content in the P. ostreatus bran was 5.48%. The hydroxyl radical scavenging method was used to compare the antioxidant activity of the fungus bran polysaccharides. The results showed that when the polysaccharide concentration was 0.1 g/L， the effect of scavenging hydroxyl radicals was 17.77%， not much different from the antioxidant properties of vitamin C at the same concentration. The method of thermal denaturation and acetone precipitation was used to study the extraction and determination of SOD in P. ostreatus fungus bran， then the pyrogenic auto-oxidation method was used to determine the activity of SOD. It was found that the content of SOD in P. ostreatus fungus bran was 25.119 μg， and the enzyme activity was 22.28 U/mL.

Key words： Pleurotus ostreatus fungus bran; polysaccharide; SOD

菌糠是以木屑、秸稈等為原料，培養(yǎng)食用菌后剩下的固體培養(yǎng)基，是食用菌的菌絲殘余及其代謝產(chǎn)物[1]。中國是食用菌大國，每年產(chǎn)生的菌糠廢棄物數(shù)量龐大，大部分的食用菌菌糠廢棄物會被當(dāng)作垃圾隨意丟棄或者焚燒，只有少部分還田或者重新用于栽培，既造成環(huán)境污染也造成資源浪費。菌糠含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，比如氨基酸、大量元素、木質(zhì)素、纖維素、菌體多糖、粗蛋白等，若將廢棄的菌糠再次利用，既可以為食用菌生產(chǎn)提供降低成本提高效益的新途徑，又可以減少環(huán)境污染，是一舉兩得的良好舉措[2-5]。本試驗對平菇菌糠中多糖及超氧化物歧化酶（SOD）進行提取和檢測研究，從而為食用菌菌糠再次利用提供一定的理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

平菇菌糠由牡丹江師范學(xué)院提供，從中挑選菌絲白密、料塊結(jié)實的菌糠塊，切除霉變和腐爛的部分，然后將其曬干，壓碎備用。靈芝培養(yǎng)料原始配方：木屑78%，麩皮20%，蔗糖1%，石膏1%。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?菌糠的處理 ?將從食用菌培養(yǎng)室取得的食用菌菌糠袋拆開，將菌糠放在托盤上，于烘干箱內(nèi)進行烘干，80 ℃下烘干24 h，期間不斷翻動菌糠，避免將菌糠烤糊，將菌糠磨粉。

1.2.2 ?多糖提取條件優(yōu)化 ?采取水提醇沉的方式提取平菇菌糠多糖，將平菇菌糠用去離子水浸泡后，控制溫度進行熬煮，靜置放涼，用4層紗布過濾后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，得到提取液。按提取液與無水乙醇1∶3的比例進行醇沉，醇沉?xí)r間為48 h（期間放入冰箱冷藏）。取出醇沉好的提取液，抽濾，去掉多余水分以及乙醇，并對濾渣進行烘干處理（烘干箱溫度85 ℃），記錄烘干后多糖的質(zhì)量。

選取提取溫度（A）、浸泡時間（B）、提取時間（C）、料液比（D）4個因素，以粗多糖的提取率為指標(biāo)，確定最佳提取條件。水平因素見表1。

1.2.3 ?粗多糖的提取 ?按照正交試驗測定的最佳提取方案，取平菇菌糠研磨粉200 g，平均分成4份進行粗多糖提取。提取步驟見“1.2.2”。

1.2.4 ?多糖抗氧化性作用 ?取4支具塞試管，分別標(biāo)記a、b、c、d。a.取1 mL濃度0.09%的水楊酸乙醇溶液，1 mL 0.1%濃度的HCl乙醇溶液，加入到10 mL定容瓶中定容，搖勻，向其中加入1 mL 0.06%濃度的FeSO4溶液，混勻。b.在a的基礎(chǔ)上加入1 mL 0.02% H2O2溶液。37 ℃反應(yīng)10 min，以去離子水為參比，510 nm處測定吸光度，記吸光度為A0。c.在a的基礎(chǔ)上加入1 mL不同濃度的多糖溶液。510 nm處測定吸光度，記吸光度為A1。d.在a的基礎(chǔ)上加入1 mL不同濃度的多糖（或維生素C）溶液，再加入1 mL 0.02% H2O2溶液，搖勻。37 ℃反應(yīng)10 min，510 nm處測定吸光度，記吸光度為A2。

羥基自由基清除率=[A0-（A2-A1）]/A0×100%

1.2.5 ?粗酶液的提取 ?稱取平菇干菌糠5 g，加水煮沸，3層紗布過濾，反復(fù)3次，收集得到粗酶液。

1.2.6 ?粗酶液的處理 ?熱變性：分別取一定體積的粗酶液，放入65 ℃的水浴鍋內(nèi)保溫10 min，然后迅速冷卻到室溫，3 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，棄去沉淀物，收集上清液。

丙酮沉淀：取一定體積的粗酶液置于冰浴中冷卻，然后在-5 ℃以下溫度操作，緩慢加入1.5倍預(yù)冷的丙酮，邊加邊攪拌均勻，靜置2～3 min，待其自然沉淀后，4 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄去上清液得到沉淀。用少量去離子水溶解沉淀，4 000 r/min、4 ℃離心5 min后即得到粗SOD酶液。

1.2.7 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及SOD含量的測定 ?取6支10 mL具塞試管，在試管中精確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，定容至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，充分混合，并在室溫下放置5 min后于595 nm處測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（表2）。

試驗中，使用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)的含量，稱取0.1 g樣品提取液，再加入0.9 mL去離子水，加入5 mL考馬斯亮藍G-250混勻放置2 min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線作對比，測定595 nm波長處的吸光度。

1.2.8 ?SOD酶活力的測定[6]

1）鄰苯三酚自氧化速率的測定。取兩支試管，根據(jù)表3先加入25 ℃預(yù)熱過的緩沖液，然后加入預(yù)熱過的鄰苯三酚（空白管用50 mmol/L Tris-HCl代替鄰苯三酚），迅速搖勻，立即倒入比色杯中，測量325 nm波長處的吸光度，每隔30 s讀取一次，測定4 min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增加或減少加入的鄰苯三酚的量以控制光吸收值）。

2）SOD樣品的活性測定。樣品管替代自氧化管。當(dāng)測定樣品管時，首先加入預(yù)熱的SOD酶液，然后加入鄰苯三酚。其余步驟與鄰苯三酚自氧化速率的測定相同（表4）。

3）樣品酶活性的計算。在25 ℃、pH 8，波長為325 nm的1 mL反應(yīng)液中，1 min抑制鄰苯三酚自氧化速率為50%的酶量定義為1個酶單位。

樣品酶活性（U/mL）=[（0.070-△A325）×100%×V總]/（0.070×50%×V0×Vs）

式中，△A325表示反應(yīng)吸光值變化值，V總表示反應(yīng)總體積，Vs表示加入樣品液的體積，V0表示活力單位定義體積（1 mL）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?正交試驗結(jié)果分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上對影響多糖提取較顯著的因素進行正交試驗，結(jié)果見表5。表5數(shù)據(jù)顯示，菌糠多糖的最佳提取方案為試驗7號，即菌糠多糖最佳提取條件為溫度100 ℃，浸泡時間0.5 h，提取時間1.5 h，料液比1∶15，此時菌糠中多糖提取率最高。

2.2 ?平菇菌糠多糖含量及抗氧化性試驗結(jié)果

在菌糠多糖最佳提取條件即溫度100 ℃，浸泡時間0.5 h，提取時間1.5 h，料液比1∶15時，提取菌糠多糖并進行抗氧化性比較（表6、表7）。

2.3 ?平菇菌糠SOD提取結(jié)果

由表3測得的OD值得出標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.005 6x，R2=0.995，平菇菌糠SOD含量平均值為25.119 μg，平菇菌糠的SOD酶活為22.28 U/mL。

3 ?討論與結(jié)論

食用菌多糖可以控制細胞分裂分化、調(diào)節(jié)細胞生長和衰老，具有抗病毒，抗腫瘤的功效[7]。超氧化物歧化酶是具有催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，平衡機體內(nèi)氧自由基功能的抗氧化酶，具有抗衰老、抗氧化、防曬等重要作用[8]。菌糠是食用菌培養(yǎng)料出菇后殘留的廢棄料，其中含有較多的纖維素、木質(zhì)素、豐富的菌絲殘體蛋白和菌絲體的次生代謝產(chǎn)物以及作物生長所必需的氮、磷、鉀等大量元素，硫、鈣、銅、鋅等中量元素和微量元素。通過試驗發(fā)現(xiàn)，平菇菌糠中可以提取出多糖及超氧化物歧化酶，這將為食用菌菌糠的再次利用提供一定依據(jù)。

參考文獻：

[1] 晏家友，張 ?純，張錦秀，等.菌糠的營養(yǎng)價值及其應(yīng)用概況[J].飼料博覽，2010（11）：41-43.

[2] 陳 ?明，王 ?晨，程 ?薇，等.中國食用菌[J].食用菌菌糠加工技術(shù)研究，2015，34（2）：1-4.

[3] 姜 ?明，潘永明，李 ?川，等.牡丹江地區(qū)食用菌菌糠在生態(tài)農(nóng)業(yè)中的綜合利用及前景展望[J].黑龍江科技信息，2016（36）：55-56.

[4] 趙曉麗，陳智毅，劉學(xué)銘.菌糠的高效利用研究進展[J].中國食用菌，2012，31（2）：1-3.

[5] 馬壽福，軍 ?花，刁治民，等.食用菌菌糠營養(yǎng)價值及利用途徑的研究[J].青海草業(yè)，2006，15（3）：36-40.

[6] 俞建瑛，姜 ?瑜，王善利.生物化學(xué)實驗技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[7] 葉忠春，梁 ?智.食用菌多糖綜述[J].輕工科技，2012（10）：16-18.

[8] 趙倩蕓，張 ?娜，楊 ?豆，等.超氧化物歧化酶在化妝品中應(yīng)用的研究進展[J].中國洗滌用品工業(yè)，2016（12）：70-73.