采用酵母雙雜交系統篩選梨ＰｂＴＭＴ４互作因子

程寅勝 楊立 陳健秋 張紹鈴 伍濤 張虎平

摘要：為篩選梨糖轉運相關蛋白PbTMT4互作因子，基于已經建立好的碭山酥梨果實發育時期的cDNA文庫，利用MatchmakerTM Gold酵母雙雜交系統，以構建的重組質粒pDHB1-PbTMT4為誘餌質粒，采用PEG/LiAc法轉化酵母菌株NMY51。利用表型篩選法檢測PbTMT4的自激活作用和毒害作用，利用氨基酸缺陷型培養基篩選PbTMT4互作因子。結果表明，誘餌蛋白PbTMT4在酵母雙雜交系統中無毒性和自激活作用。通過酵母雙雜交篩選以及測序和序列比對分析，共獲得13個與PbTMT4蛋白相互作用的宿主蛋白。

關鍵詞：PbTMT4;酵母雙雜交系統;cDNA文庫;互作因子

中圖分類號：S661.2 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）24-0240-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.24.058 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening PbTMT4 interaction factor by yeast two-hybrid system in pear

CHENG Yin-sheng1，YANG Li1，CHEN Jian-qiu2，ZHANG Shao-ling2，WU Tao1，ZHANG Hu-ping2

（1.Institute of Fruit Tree Tea，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China;

2.College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Abstract： To screen for the interaction factor of PbTMT4， a pear sugar transport related gene， based on the established cDNA library of Dangshan Suli pear fruit development period， using MatchmakerTM Gold yeast two-hybrid system， the constructed recombinant plasmid pDHB1-PbTMT4 was used as a bait plasmid to transform yeast strain NMY51 by PEG/LiAc method. The phenotypic screening method was used to detect the self-activation and toxic effects of PbTMT4. The PbTMT4 gene interaction factor was screened using an amino acid-deficient medium. The results showed that the bait protein PbTMT4 was non-toxic and self-activating in the yeast two-hybrid system. Through yeast two-hybrid screening and sequencing and sequence alignment analysis， a total of 13 host proteins interacting with PbTMT4 protein were obtained.

Key words： PbTMT4; yeast two-hybrid system; cDNA library; interaction factor

液泡膜單糖轉運蛋白（Tonoplast monosaccharide transporter，TMT）是定位于液泡膜的單糖轉運蛋白，負責糖在胞質和液泡之間的轉運[1]，屬于協助擴散超家族（Major facilitator superfamily，MFS），也稱為共轉運蛋白家族，在所有的生物中都有發現[2]。在分子和功能水平上的研究表明，它是具有葡萄糖和果糖轉運能力的液泡載體蛋白[2，3]。擬南芥液泡膜單糖轉運蛋白AtTMT參與液泡內單糖的累積，低溫、干旱、鹽脅迫可以誘導該蛋白的表達，說明該蛋白參與擬南芥對滲透脅迫的應答[4]。植物中關于糖轉運互作機理的研究極其少見，在蘋果中通過酵母雙雜交試驗表明，液泡膜葡萄糖轉運蛋白基因MdVGT1與MdTMT1在體外能相互作用，其可能與MdTMT1互作共同轉運葡萄糖進入液泡膜[5]。梨中被鑒定出6個TMT家族成員（PbTMT1-PbTMT6），并且認為PbTMT4基因與果實發育和成熟過程中糖的積累密切相關，是影響果實品質的重要候選基因[6-8]。隨后研究表明，PbTMT4定位于液泡膜上，能夠顯著提高轉基因植物糖含量，同時對植株的生長發育具有促進作用[9，10]。逆境處理發現，PbTMT4轉基因株系較野生型植株受到的傷害小，表明該基因可能在抗非生物脅迫中起重要的調控作用[10]。本研究希望通過酵母雙雜交技術，利用梨果實cDNA文庫，初步篩選PbTMT4的互作因子，為進一步深入研究該基因在糖轉運機制和植株生長發育中的分子調控機制提供基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試樣品碭山酥梨（Pyrus bretschneideri，Dangshan Suli）果實采自南京農業大學江浦農場園藝試驗站。碭山酥梨果實發育時期cDNA文庫、表達載體pDHB1和用于轉化的NMY51酵母菌株由南京農業大學國家梨產業技術研發中心保存。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和農桿菌GV3101購自南京百思禾生物科技有限公司。pDHB1載體由南京農業大學國家梨產業技術研發中心實驗室保存。膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自南京偉沃生物科技有限公司。酵母提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。碭山酥梨果實發育時期cDNA文庫為南京農業大學國家梨產業技術研發中心實驗室保存，MatchmakerTM Gold酵母雙雜交系統試劑盒及各種酵母缺陷型培養基均購自Clontech公司。

1.2 ?RNA提取和cDNA合成

使用成都福際生物技術有限公司多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取。反轉錄試劑盒TransScript？誖One-Step RT-PCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 ?基因克隆引物設計

從梨基因組數據庫中下載目的基因PbTMT4的CDs參考序列，利用軟件SnapGene設計基因克隆引物，上游引物均包含5′端起始密碼子（ATG），下游引物保留3′端終止密碼子（TAA）。同時根據PbTMT4基因酶切位點、pDHB1酶切位點圖譜，在基因克隆上游引物序列5′端和下游引物序列3′端分別加入合適的酶切位點。選取的酶切位點5′端和3′端均為SfiI（表1）。

1.4 ?基因克隆及誘餌表達載體構建

利用參考序列引物，以碭山酥梨果實cDNA為模板，經過PCR擴增得到產物連接到pEASY-T1載體上，經PCR驗證后由北京擎科生物技術有限公司測序。利用DNAMAN軟件分析測序結果和參考序列的一致性，將測序正確的轉化子經酶切后和表達載體pDHB1利用T4DNA連接酶連接，構建重組質粒pDHB1-PbTMT4。經過酶切和測序（測序引物）檢測正確的重組質粒，利用凍融法轉入農桿菌GV3101。再反轉大腸桿菌DH5α，提取其質粒進行酶切鑒定。

1.5 ?誘餌蛋白毒性及自激活活性檢測

將PbTMT4-pDHB1和空載pDHB1分別單轉入酵母菌株NMY51，涂布SD/-leu培養板，PCR驗證正確后，分別用去離子水重懸，稀釋不同濃度，分別吸取20 μL垂直滴于SD/-leu培養板，比較各組菌液的生長狀況，如果沒有區別，即說明該融合蛋白對酵母無毒性，可以用于文庫篩選。

將PbTMT4-pDHB1和pPR3空載質粒共同轉入NMY51酵母細胞，同時將空載對照PDHB1+pPR3、陽性對照NubI+pDHB1以及陰性對照NubI+pPR3同時轉化，涂于SD/-trp/-leu培養板，培養3～4 d后，用去離子水分別重懸4組轉化后的菌體，分別吸取20 μL滴到SD/-trp/-leu培養板和SD/-trp/-leu/-His/-Ade培養板，30 ℃培養3～5 d觀察結果。

1.6 ?PbTMT4互作因子初步篩選及分析

誘餌載體PbTMT4-PDHB1與文庫質粒共轉入感受態酵母菌株NMY51，涂布于三缺SD/-trp/-leu/-His平板，長點后提取其菌液質粒進行PCR檢測（引物pPR3-F/pPR3-R），吸取2 μL進行凝膠電泳檢測，長度大于200 bp PCR產物送公司測序。對上一步篩選出的陽性克隆在測序后，利用BLAST對結果進行同源性分析、比對（http：//202.195.250.6/wp/），并利用TAIR（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）在線工具分析陽性克隆所代表基因的來源與蛋白功能等相關信息。

2 ?結果與分析

2.1 ?PbTMT4基因克隆及融合載體構建

以碭山酥梨果實cDNA為模板，PCR擴增得到該基因（圖1A）CDS序列，測序結果表明該基因大小為2 211 bp（圖2）。

測序正確的轉化子和酵母表達載體pDHB1同時利用Sfi I進行酶切，回收產物利用T4-DNA連接酶連接，構建重組質粒PbTMT4-pDHB1。經過酶切和測序（測序引物，表1）檢測正確的重組質粒利用凍融法轉入農桿菌GV3101。再反轉大腸桿菌DH5α，提取其質粒進行酶切鑒定（圖1B）。

2.2 ?酵母轉化

采用PEG/LiAc法將構建好的載體PbTMT4-pDHB1轉化酵母菌株NMY51，轉化成功后進行PCR驗證（圖3），進一步測序正確的菌株進行后續試驗。

2.3 ?自激活和毒性試驗

將TMT4-pDHB1重組質粒和空載pPR3質粒共同轉入NMY51酵母菌株，分別吸取20 μL菌液垂直滴在SD/-trp/-leu和SD/-trp/-leu/-His/-Ade平板，結果如圖4所示，在二缺SD平板所有的酵母菌株都有生長，而在四缺SD平板，只有陽性對照生長。結果表明，PbTMT4基因本身沒有自激活現象，可以進行酵母互作試驗。

將轉化有重組質粒PbTMT4-pDHB1的酵母和轉空載pDHB1酵母重懸，并分別稀釋10倍、100倍、1 000倍，垂直滴在SD/-Leu平板，發現兩類菌落生長狀況沒有明顯差異（圖5），說明PbTMT4基因對NMY51酵母菌株無毒害作用。

2.4 ?酵母雙雜交篩選及陽性菌落分析

以PbTMT4為誘餌蛋白，從最早長出來的菌落中挑出100個生長良好的進行質粒抽提，然后對文庫質粒擴增并進行測序分析。利用BLAST對測序結果進行同源性分析和比對（http：//202.195.250.6/wp/），并利用NCBT（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線工具分析陽性克隆所代表基因的來源與蛋白功能等信息（表2）。

分析表明，Na+/H+反向轉運蛋白是一類廣泛存在于酵母、藻類和高等植物的轉運蛋白，定位于細胞質膜和液泡膜上，將Na+從細胞質中排出和將Na+區隔化于液泡中都需要借助于Na+/H+反向轉運蛋白[11-13]，這類基因過量表達可提高轉基因植物的抗鹽性[14，15]。

過氧化物酶（Peroxidase）是植物酶促防御系統的關鍵酶之一，對有機過氧化物和過氧化氫各種無機和有機氧化物具有催化作用[16]。與過氧化氫酶、超氧化歧化酶協同清除植物體內過剩自由基，以提高植物抗逆性。

磷脂酶和脂激酶是磷脂產生磷脂酸、溶血磷脂酸、鞘氨醇-1-磷酸、六磷酸肌醇和三磷酸肌醇的重要酶，產物參與細胞間的信號傳遞過程[17-19]。

NAD（P）結合的Rossmann折疊超家族蛋白具有氧化還原活性，結合、催化活性，參與植物體內的多種氧化還原和代謝過程，定位于雄配子體，花期表達（NCBI BLink）。

堿性亮氨酸拉鏈（Basic region/leucine zipper motif，bZIP）是由1個亮氨酸拉鏈二聚體和1個DNA結合域構成，是較大的轉錄因子基因家族之一，普遍存在于所有真核生物[20]。

組蛋白是真核生物體內細胞染色質中堿性蛋白，研究表明，組蛋白在轉錄調控過程中是不可或缺的，會發生很多共價化學修飾，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化以及ADP-核糖基化等，從而影響基因的表達[21]。組蛋白修飾在與植物生長過程如開花和抗逆之間的關系還在進一步研究中。

富含半胱氨酸蛋白（Cystein-rich protions，CRPs）廣泛存在于植物體內，是一類分泌蛋白，具有防御、蛋白酶抑制、重金屬解毒等生物學功能[22]，同時，CRPs還參與調節植物的生長、發育和生殖等[23]。植物CRPs的數量和種類很多，快速堿化因子（Rapid alkalinization factors，RALF）能迅速激活有絲分裂蛋白激酶，可逆性的調控番茄與擬南芥種子萌發時根生長和根毛形成[24]，抑制花粉管的伸長[25]。柱頭/花柱富含半胱氨酸黏附素（Stigma/Style cysteine-rich adhesin，SCA）特異性地在百合柱頭和花柱表達[26]，SCA的生物活性可以促使Chemocyanin與花粉管的結合，誘導花粉管定向生長[27]，RALF和SCA都屬于該超家族。

3 ?討論

酵母雙雜交系統（Yeast two-hybrid system）是一種建立于酵母體內的用于研究蛋白質之間相互作用的基因系統[28]。研究蛋白質之間的相互作用，一方面可以從分子水平揭示蛋白質功能，另一方面，對于研究植物生長、發育、分化和凋亡等生命規律至關重要，對研究植物調控機理、發現新蛋白功能及建立蛋白質互作網絡等提供了重要的理論基礎。酵母雙雜交技術作為研究蛋白互作的一種新的技術手段，在近代研究中已經取得了重大進展。其靈敏度高的優點，能夠將蛋白質之間微弱的、瞬間的作用描述下來。

本研究初步篩選出的13個PbTMT4基因互作因子中，其中有3個參與植物的生長發育，包括可逆調節植物根生長和根毛形成的富含半胱氨酸蛋白[24]、參與很多氧化還原和代謝過程的Rossmann折疊超家族蛋白和參與組織細胞分化生長的堿性亮氨酸拉鏈蛋白;有5個具有防御生物或非生物脅迫的蛋白，包括具有重金屬解毒功能的富含半胱氨酸蛋白、可提高轉基因植物的抗鹽性的Na+/H+反向轉運蛋白、清除植物體內過剩自由基的過氧化物酶、轉錄因子堿性亮氨酸拉鏈以及具有修飾作用的組蛋白[21];有3個參與了植物的生殖生長，CRPs超家族中抑制花粉管伸長的快速堿化因子[24]和誘導花粉管定向生長的柱頭/花柱富含半胱氨酸黏附素[26]、控制植物開花的組蛋白、定位于雄配子體花期表達的Rossmann折疊超家族蛋白;還有影響細胞間信號傳導的磷脂酶[29]。這些結果初步表明，PbTMT4在植物體內參與了復雜的生命代謝過程，包括植物的營養生長、生殖生長、逆境脅迫以及信號傳導等多種生命過程。本研究為探究PbTMT4基因功能提供了更多更新的思路，更細致的機理有待進一步研究。

參考文獻：

[1] WORMIT A，TRENTMANN O，FEIFER I，et al. Molecular identification and physiological characterization of a novel monosaccharide transporter from Arabidopsis involved in vacuolar sugar transport[J].The plant cell，2006，18（12）：3476-3490.

[2] MARGER M D，SAIER M H. A major superfamily of transmembrane facilitators that catalyse uniport，symport and antiport[J].Trends in biochemical sciences，1993，18（1）：13-20.

[3] SCHULZ A，BEYHL D，MARTEN I，et al. Proton-driven sucrose symport and antiport are provided by the vacuolar transporters SUC4 and TMT1/2[J].The Plant journal，2011，68（1）：129-136.

[4] NEUHAUS H E. Transport of primary metabolites across the plant vacoular membrane[J].FEBS letters，2007，581（12）：2223-2226.

[5] 許海峰，劉靜軒，王意程，等.蘋果液泡膜葡萄糖轉運蛋白基因MdVGT1的克隆與表達分析[J].中國農業科學，2016，49（23）：4584-4592.

[6] LI J M，ZHENG D M，LI L T，et al. Genome-wide function， evolutionary characterization and expression analysis of sugar transporter family genes（Pyrus bretschneideri Rehd）[J].Plant & cell physiology，2015，56（9）：1721-1737.

[7] LI J M，HUANG X S，LI L T，et al. Proteome analysis of pear reveals key genes associated with fruit development and quality[J].Planta，2015，241（6）：1363-1379.

[8] CHENG R，ZHANG H P，CHENG Y S，et al. In silico and expression analysis of the tonoplast monosaccharide transporter（TMT） gene family in Pyrus bretschneideri[J].Journal of horticultural science & biotechnology，2018，93（4）：366-376.

[9] CHENG R，CHENG Y S，L？譈 J H，et al. The gene PbTMT4 from pear （Pyrus bretschneideri） mediates vacuolar sugar transport and strongly affects sugar accumulation in fruit[J].Physiologia plantarum，2018，164（3）：307-319.

[10] 程寅勝，陳健秋，陳 ?丹，等.梨糖轉運相關基因PbTMT4啟動子克隆及功能分析[J].園藝學報，2019，46（1）：25-36.

[11] BLUMWALD E，POOLE R J. Nitrate storage and retrieval in Beta vulgaris：Effects of nitrate and chloride on proton gradients in tonoplast vesicles[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，1985，82（11）：3683-3687.

[12] 呂慧穎，李銀心，孔凡江，等.植物Na+/H+逆向轉運蛋白研究進展[J].植物學報，2003，20（3）：363-369.

[13] APSE M P，AHARON G S，SNEDDEN W A，et al. Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+ antiport in Arabidopsis[J].Science，1999，285（5431）：1256-1258.

[14] LIU H，WANG Q Q，YU M M，et al. Transgenic salt-tolerant sugar beet （Beta vulgaris L.） constitutively expressing an Arabidopsis thaliana vacuolar Na+/H+ antiporter gene，AtNHX3，accumulates more soluble sugar but less salt in storage roots[J].Plant，cell & environment，2008，31（9）：1325-1334.

[15] RAJAGOPAL D，AGARWAL P，TYAGI W，et al. Pennisetum glaucum Na+/H+ antiporter confers high level of salinity tolerance in transgenic Brassica juncea[J].Molecular breeding，2007， 19（2）：137-151.

[16] DUNFORD H B，STILLMAN J S. On the function and mechanism of action of peroxidases[J].Coordination chemistry reviews，1976， 19（3）：187-251.

[17] COURSOL S，FAN L M，STUNFF H L，et al. Sphingolipid signalling in Arabidopsis guard cells involves heterotrimeric G proteins[J].Nature，2003，423（6940）：651-654.

[18] NG C K Y，CARR K，MCAINSH M R，et al. Drought-induced guard cell signal transduction involves sphingosine-1-phosphate[J].Nature，2001，410（6828）：596-599.

[19] LEMTIRI-CHLIEH F，MACROBBIE E A C，WEBB A A R，et al. Inositol hexakisphosphate mobilizes an endomembrane store of calcium in guard cells[J].Proceedings of the national academy of sciences of the united states of america，2003，100（17）：10091-10095.

[20] LANDSCHULZ W H，JOHNSON P F，MCKNIGHT S L. The leucine zipper：A hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins[J].Science，1988，240（4860）：1759-1764.

[21] LOIDL P. A plant dialect of the histone language[J].Trends in plant science，2004，9（2）：84-90.

[22] BENKO-ISEPPON A M，GALDINO S L，CALSA JR T，et al. Overview on plant antimicrobial peptides[J].Current protein & peptide science，2010，11（3）：181-188.

[23] MINGOSSI F B，MATOS J L，RIZZATO A P，et al. SacRALF1，a peptide signal from the grass sugarcane （Saccharum spp.），is potentially involved in the regulation of tissue expansion[J].Plant Mol Biol，2010，73（3）：271-281.

[24] PEARCE G，MOURA D S，STRATMANN J，et al. RALF，a 5-kDa ubiquitouspolypeptide in plants，arrests root growth and development[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（22）：12843-12847.

[25] COMBIER J P，K？譈STER H，JOURNET E P，et al. Evidence for the involvement in nodulation of the two small putative regulatory peptide-encoding genes MtRALFL1 and MtDVL1[J].Mol Plant Microbe Interact，2008，21（8）：1118-1127.

[26] PARK S Y，JAUH G Y，MOLLET J C，et al. A lipid transfer-like protein is necessary for lily pollen tube adhesion to an in vitro stylar matrix[J].The plant cell，2000，12（1）：151-163.

[27] KIM S，MOLLET J C，DONG J，et al. Chemocyanin，a small basic protein from the lily stigma，induces pollen tube chemotropism[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（26）：16125-16130.

[28] SOELLICK T R，UHRIG J F. Development of an optimized interaction-mating protocol for large-scale yeast two-hybrid analyses[J].Genome biology，2001，2（12）：1-7.

[29] ENGLISH D. Phosphatidic acid：A lipid messenger involved in intracellular and extracellular signalling[J].Cellular signalling，1996，8（5）：341-347.