肺泡灌洗液Gene Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)在肺結(jié)核早期診斷中的臨床應(yīng)用價值*

王敏媛，梁亞萍

陜西省結(jié)核病防治院(西安710100)

結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis，MTB)俗稱結(jié)核桿菌，屬于人類重要胞內(nèi)病原微生物，是結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺部最多見。我國患病人數(shù)居全球第三位，且耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。造成這一嚴(yán)峻形勢的原因：一方面，缺乏敏感度高的診斷方法，延誤了患者的診斷和治療；另一方面，作為金標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)核菌培養(yǎng)檢查方法耗時較長，滯后于臨床診治需要，導(dǎo)致耐藥結(jié)核病傳播的機(jī)會增加。因此，如何快速完成對肺結(jié)核特別是涂陰和耐藥肺結(jié)核的確診對于結(jié)核病的防控具有十分重要的意義。Gene Xpert MTB/RIF是WHO最新推薦的肺結(jié)核診斷的一線快速檢測方法，可同時檢測結(jié)核分枝桿菌及其利福平耐藥，具有全封閉的檢測系統(tǒng)、全自動化操作、污染可能性小、人為影響因素少、結(jié)果準(zhǔn)確度高及檢測周期短等優(yōu)點(diǎn)[1]。但該方法在國內(nèi)應(yīng)用較晚，使用率不高。大部分肺結(jié)核患者的臨床癥狀不明顯，留取的痰標(biāo)本合格率低，從而影響檢出率，而肺泡灌洗液(BALF)由于留取方法不同，可提高陽性檢出率，故對結(jié)核病的診斷有重要價值。本文即應(yīng)用Gene Xpert MTB/RIF檢測1000例患者的BALF標(biāo)本，并與濃縮集菌涂片抗酸染色、分枝桿菌液體培養(yǎng)和傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果進(jìn)行比對，評估其檢測效能，為該技術(shù)進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

對象與方法

1 研究對象 根據(jù)“結(jié)核病診斷和治療指南”[2]，收集 2018 年 1—12 月在本院就診的疑似肺結(jié)核患者的BALF標(biāo)本1000例為研究對象，年齡6～78歲，男616例，女384例。其中確診肺結(jié)核患者標(biāo)本891例為觀察組，排除結(jié)核病患者標(biāo)本109例為對照組。每一份BALF標(biāo)本均行濃縮集菌涂片抗酸染色、分枝桿菌液體培養(yǎng)及比例法藥敏試驗(yàn)(培養(yǎng)陽性者)和Gene Xpert MTB/RIF法三種檢測方法檢測。

2 試劑與儀器 Gene Xpert MTB/RIF 儀器及配套試劑：美國Cepheid公司；BACTEC MGITTM960 液體培養(yǎng)系統(tǒng)、MGIT液體培養(yǎng)管、分枝桿菌聯(lián)合藥敏試劑盒、分枝桿菌培養(yǎng)添加試劑盒：美國BD公司；抗酸染色液：珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

3 檢測方法

3.1 濃縮集菌涂片抗酸染色：按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[3]中的相關(guān)要求操作及報告抗酸染色結(jié)果。

3.2 培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：參照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[4]及產(chǎn)品說明書中的操作要求進(jìn)行BACTEC MGITTM960液體培養(yǎng)檢測。將0.5 ml處理后的BALF標(biāo)本加入MGIT液體培養(yǎng)管中，置于BACTEC MGITTM960液體培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)；對培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)一步行藥敏試驗(yàn)。BACTEC MGITTM960 系統(tǒng)藥敏試驗(yàn)是將從結(jié)核病患者標(biāo)本中分離到的MTB在已知濃度檢測藥物存在的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察其生長情況，同時與不加任何藥物的對照管進(jìn)行比較，若菌株在對照管及藥物培養(yǎng)管中均生長，則認(rèn)為該菌株對該藥物耐藥(R)；若只在對照管中生長，則認(rèn)為該菌株對該藥物敏感(S)。

3.3 Gene Xpert MTB/RIF 核酸擴(kuò)增檢測：按照Gene Xpert MTB/RIF 操作說明書上的步驟，吸取1 ml BALF標(biāo)本加入前處理管中，然后加入相當(dāng)于2倍BALF 標(biāo)本體積的Gene Xpert 樣品試劑(SR)，將前處理管旋緊，渦旋振蕩15～30 s后，于室溫靜置15 min，打開反應(yīng)盒，用無菌吸管吸取2 ml 處理后的樣品由加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒中，置于檢測模塊，儀器開始自動化檢測；儀器自動過濾和洗滌樣品，將超聲溶菌釋放出的DNA與PCR反應(yīng)試劑混合，半巢式實(shí)時擴(kuò)增并檢測熒光信號，根據(jù)循環(huán)閾值(Cycle threshold，CT)值的高(CT<16)、中(1628)的判定標(biāo)準(zhǔn)[5]，2 h后儀器給出的檢測結(jié)果可直接在檢測系統(tǒng)窗口下觀察。結(jié)果判斷依照探針的CT值，當(dāng)內(nèi)對照探針CT值≤38 即為陽性。5個探針中至少2個探針CT值≤38 即為檢測到MTB。該方法檢測利福平耐藥的基礎(chǔ)在于MTB特異性分子信標(biāo)早期CT值和晚期CT值之差，即ΔCT值，當(dāng)ΔCT > 3.5時提示對利福平耐藥；當(dāng)ΔCT≤3.5時提示對利福平敏感[6]。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組患者Gene Xpert MTB/RIF法檢測陽性率比較 BALF Gene Xpert MTB/RIF法檢測觀察組陽性率為71.2%(634/891)，對照組陽性率為1.8%(2/109)，且兩組結(jié)果比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 觀察組濃縮集菌涂片抗酸染色、分枝桿菌液體培養(yǎng)及Gene Xpert MTB/RIF法檢測陽性率比較 觀察組BALF濃縮集菌涂片抗酸染色陽性率為21.2%(189/891)；分枝桿菌液體培養(yǎng)陽性率為36.7%(327/891)；Gene Xpert MTB/RIF法檢測陽性率為71.2%(634/891)。三種檢測方法的陽性率比較：Gene Xpert MTB/RIF檢測法>分枝桿菌液體培養(yǎng)法>濃縮集菌涂片抗酸染色；經(jīng)兩兩比較，三者結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

3 觀察組Gene Xpert MTB/RIF法對涂陰及涂陽標(biāo)本中MTB的檢測效能分析

3.1 濃縮集菌涂片抗酸染色鏡檢陽性時，分枝桿菌液體培養(yǎng)和Gene Xpert MTB/RIF法的陽性率比較：891份BALF標(biāo)本中，涂陽189例，使用分枝桿菌液體培養(yǎng)法檢測陽性169例(89.4%，169/189)；使用Gene Xpert MTB/RIF法檢測陽性176例(93.1%，176/189)。兩種檢測方法結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.2 濃縮集菌涂片抗酸染色鏡檢陰性時，分枝桿菌液體培養(yǎng)和Gene Xpert MTB/RIF法的陽性率比較：891份BALF標(biāo)本中，涂陰702例，使用分枝桿菌液體培養(yǎng)法檢測陽性158例(22.5%，158/702)；使用Gene Xpert MTB/RIF法檢測陽性458例(65.2%，458/702)。兩種檢測方法結(jié)果比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4 Gene Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥的效能 觀察組中327份分枝桿菌液體培養(yǎng)陽性的標(biāo)本經(jīng)Gene Xpert MTB/RIF法檢測亦為陽性，對這327份陽性標(biāo)本進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，檢測利福平是否耐藥。藥敏試驗(yàn)檢測利福平耐藥為14例，而Gene Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥為17例；在藥敏試驗(yàn)中耐藥的14例標(biāo)本經(jīng)Gene Xpert MTB/RIF法檢測亦為耐藥。以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Gene Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥的靈敏度為100.0%(14/14)，特異度為99.0%(310/313)，兩種方法檢測結(jié)果一致性較高。

討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌。WHO報道，每年約有800萬新增病例，至少有300萬人死于肺結(jié)核，所以結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。能夠快速檢測出各類標(biāo)本中的MTB、輔助臨床醫(yī)生及早確診，既是結(jié)核病研究領(lǐng)域中需要持續(xù)改進(jìn)的重大課題，也是結(jié)核病防治中最重要的環(huán)節(jié)之一[7]。直接涂片抗酸染色法和分枝桿菌液體培養(yǎng)法是目前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的主要方法，他們各具優(yōu)缺點(diǎn)。直接涂片抗酸染色法具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但缺點(diǎn)是結(jié)果受人為影響因素較大，只能判斷菌體形態(tài)、無法區(qū)分細(xì)菌死活及菌種類型，并對標(biāo)本中含菌量要求高，一般標(biāo)本中結(jié)核菌數(shù)量≥1×104個/ml時才可檢出陽性，故其陽性檢出率低；雖然結(jié)核菌培養(yǎng)是確診結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，且分枝桿菌液體培養(yǎng)法能提高一定的陽性檢出率，可在區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌(NTM)的同時檢測結(jié)核菌的耐藥性，但所需時間較長，恐延誤疾病的診治，從而增加疾病傳播的風(fēng)險[8]。美國Cepheid公司開發(fā)的Gene Xpert MTB/RIF檢測方法是一種半巢式熒光定量PCR體外診斷技術(shù)，它針對rpoB基因81bp利福平耐藥核心區(qū)間(RRDR)設(shè)計(jì)引物、探針，檢測其是否發(fā)生突變[9]，能直接從患者新鮮BALF里同時檢測MTB及其是否對利福平耐藥(rpoB序列存在突變)，整個檢測時間約為2 h，適于臨床應(yīng)用。國內(nèi)外研究均表明該方法檢測的敏感度和特異度都高于目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的檢測方法[10-12]，在短時間內(nèi)可同時提供MTB及其利福平耐藥性的確診依據(jù)。

從痰標(biāo)本中檢測MTB是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的方法，但現(xiàn)階段，我國約有70%涂陰肺結(jié)核患者，他們往往臨床癥狀不明顯，咳痰少甚至無，故很難留取合格的痰標(biāo)本，加之目前尚缺乏對痰標(biāo)本有效的檢測方法，使MTB從痰標(biāo)本中檢出的幾率降低。支氣管鏡檢查采集的肺泡表面襯液即為BALF，具有污染率低(采集不經(jīng)過口腔和咽喉)、菌含量高(灌洗部位為病灶所在的肺葉、肺段)的優(yōu)點(diǎn)，是理想的病原學(xué)檢查標(biāo)本，對其進(jìn)行檢測，可增加陽性檢出率，進(jìn)而提高對結(jié)核病的診斷效率。

本文中兩組患者均行支氣管鏡檢查，留取BALF進(jìn)行檢測。兩組BALF Gene Xpert MTB/RIF法檢測陽性率比較：觀察組為71.2%>對照組為1.8%，且兩組結(jié)果比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Gene Xpert MTB/RIF法檢測BALF有較高的特異度，與牛波等[13]報道結(jié)果一致。觀察組891例BALF濃縮集菌涂片抗酸染色、分枝桿菌液體培養(yǎng)及Gene Xpert MTB/RIF法檢測陽性率比較結(jié)果：Gene Xpert MTB/RIF檢測法(71.2%)>分枝桿菌液體培養(yǎng)法(36.7%)>濃縮集菌涂片抗酸染色(21.2%)，提示使用Gene Xpert MTB/RIF法檢測BALF的檢測效能高于濃縮集菌涂片抗酸染色法及分枝桿菌液體培養(yǎng)法，這與李妍等[14]報道的結(jié)果一致。觀察組中濃縮集菌涂片抗酸染色鏡檢陽性(189例)時，分枝桿菌液體培養(yǎng)和Gene Xpert MTB/RIF法的陽性率比較：分枝桿菌液體培養(yǎng)法檢測陽性率為89.4%，Gene Xpert MTB/RIF法檢測陽性率為93.1%，兩種檢測方法結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；濃縮集菌涂片抗酸染色鏡檢陰性(702例)時，分枝桿菌液體培養(yǎng)和Gene Xpert MTB/RIF法的陽性率比較：分枝桿菌液體培養(yǎng)法檢測陽性率為22.5%，Gene Xpert MTB/RIF法檢測陽性率為65.2%，兩種檢測方法結(jié)果比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示在標(biāo)本含菌量低時，Gene Xpert MTB/RIF法由于檢測靈敏度優(yōu)于分枝桿菌液體培養(yǎng)法，故更適于對臨床上涂陰肺結(jié)核患者的實(shí)驗(yàn)室診斷。有文獻(xiàn)報道，Gene Xpert MTB/RIF檢測法僅對MTB有特異性，與NTM無交叉反應(yīng)[15]，提示如果涂片陽性但Gene Xpert MTB/RIF法檢測陰性者，不排除NTM感染的可能性。

以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Gene Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥性的靈敏度為100.0%，特異度為99.0%，兩種方法的檢測結(jié)果一致性較高，與國外文獻(xiàn)報道一致[16]。Guenaui等[17]報道大約90%對利福平耐藥的菌株會同時對異煙肼耐藥，所以檢測是否對利福平耐藥，在一定程度上可作為耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的監(jiān)測指標(biāo)，很大程度上縮短了MDR-TB的診斷時間，也能控制MDR-TB的傳播[18]。

綜上所述，Gene Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)是一種以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的新型結(jié)核病檢測平臺，能夠快速、特異地檢測肺泡灌洗液中結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥，尤其適用于臨床上涂陰肺結(jié)核患者的診斷，對結(jié)核病的早期診斷具有重要意義。在結(jié)核病高發(fā)和耐藥形勢嚴(yán)峻的地區(qū)，開展Gene Xpert MTB/RIF檢測對于提高臨床醫(yī)生對疑似結(jié)核病患者的診治能力、快速診斷耐藥結(jié)核病、指導(dǎo)臨床合理用藥，具有重要的應(yīng)用價值。