HIV的實驗室檢測方法研究進展

臧 旭

獲得性免疫缺陷綜合征（艾滋?。┦悄壳坝蒆IV病毒引起的最具破壞性的疾病之一，傳染性強，病死率高。從全球范圍來看，非洲區域病情最嚴重，僅2017年艾滋病毒新發感染數占全球的近2/3。我國自1985年發現第一例艾滋病患者以來，艾滋病患者不斷增多。2010年—2016年，中國艾滋病發病數和死亡人數總體呈上升趨勢。2017年全國艾滋病發病數已達57 194例，是2010年全年發病數的近3倍［1］。

研究表明，從靈長類慢病毒到人類的HIV的跨物種傳播，病毒可以在系統發育上分為兩類；HIV-1和HIV-2［2］。這種區別對于準確監測和診斷以及在人群中施用適當的抗反轉錄病毒療法至關重要，目前艾滋病毒1型（HIV-1）是人類反轉錄病毒中的第一種，占世界艾滋病毒感染的95%以上［3］。艾滋病病毒在人體內的平均潛伏期為8～9年，患者無任何癥狀，外表與常人無異，但是由于HIV病毒主要攻擊的是人體的免疫系統，一旦侵入機體細胞，病毒將會和細胞整合在一起終生難以消除，T4淋巴組織受損導致人體最終因合并感染各種疾病甚至死亡［4］。HIV病毒廣泛存在于感染者的血液、精液、陰道分泌物、乳汁、腦脊液、有神經癥狀的腦組織液中，其中以血液、精液、陰道分泌物中濃度最高［5］，最主要的傳播方式也是通過傳播以上幾種物質產生，如性傳播、血液傳播和母嬰傳播［6］。由于艾滋病病毒的高致病性及傳染性，早期對疑似感染者的檢測就顯得尤為重要。目前檢測HIV感染者體液中病毒抗原和抗體的方法，操作方便，易于普及應用，其中抗體檢測尤為普遍［7］。但HIV P24抗原和病毒基因的測定，在HIV感染檢測中的地位和重要性也日益受到重視［8］。該文就近年來HIV實驗室檢測的研究進展和發展趨勢綜述如下。

1 抗體檢測

1.1 初篩實驗 血清中HIV抗體是判斷HIV感染的間接指標。根據其主要的適用范圍，可將現有HIV抗體檢測方法分為篩檢試驗和確證試驗。初篩主要包括酶聯免疫吸附測定（ELISA），凝膠顆粒凝集試驗，乳膠凝集試驗，放射免疫試驗和各種快速檢測試驗等［9］。ELISA可使用血液、唾液、尿液樣品將已知的抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗體反應在固相表面進行的技術。其中ELISA是目前進行HIV抗體初篩最有效也是最常用的檢測手段，目前ELISA的試劑已開發到第4代［10］。第1代試劑主要以病毒裂解物或部分純化的病毒抗原包被反應板，由于含有宿主細胞成分的污染和雜蛋白的存在，故假陽性較高。目前國內外主要使用第3代（雙抗原夾心法）試劑。血液樣品的篩查仍以第3代ELISA為主，國際上有些國家和地區已將第4代ELISA試劑用于血源篩查，目前第4代ELISA試劑可同時檢測p24抗原和HIV-1/2抗體［11］。吳忠華等對目前市售的三種進口第4代試劑盒進行性能評價，發現所用的第4代試劑敏感性均高于第3代檢測試劑［12］。與第3代試劑相比，第4代試劑檢測窗口期大約平均縮短4～5 d［13］。第1代到第 4代的ELISA檢測方法對比研究結果發現，ELISA試驗適合用于大批量標本的檢測，而第3代ELISA更適用于目前的臨床檢測條件，因其具有較高的特異性和敏感性［14］。由于ELISA檢測依賴于化學發光和時間分辨熒光免疫分析技術等方法，其靈敏度較低，并且第4代試劑的成本更高，所以若全面取代第3代檢測試劑，還需要進一步研究和考證。

由于HIV的高危險性，對于檢測試劑和手段的需求不僅包括高特異性和靈敏度，同時也要求更加方便快捷準確，所以進行HIV的快速檢測試驗（RT），能夠在 10～30 min內得到結果，可用于急診檢測。包括凝膠顆粒凝集試驗（PA），它是通過包被HIV抗原的顆粒凝集來檢測抗體的存在，根據其凝集反應判斷結果；免疫斑點試驗，通過使用硝酸纖維膜作為固相載體，將HIV固定在其膜上，加入樣品后陽性結果將以有色斑點的形式出現在膜上抗原部位；免疫層析試驗，以硝酸纖維膜為載體將HIV抗原固定在膜上，加入待測樣品后由于層析作用復合物沿著固相載體遷移，陽性結果以紅色條帶的形式產生，由于該方法靈敏度不及ELISA試驗但是試劑可以常溫保存并且步驟簡單快速，所以適用于基層實驗室篩查［15］。 張宏萍［16］對三種 HIV 的篩查方法進行比較，即，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、明膠顆粒凝集試驗（PA）和免疫斑點試驗，對于初篩陽性標本都沒有漏檢現象，檢出率敏感性均為100%；PA法檢測時不需要任何儀器但是相對檢測時間較長，免疫斑點試驗試劑穩定操作簡便且特異性高于ELISA和PA法。劉福榮［17］對RT法與ELISA法進行比較，結果發現ELISA假陽性率為80%（40/50），RT法為23.5%（4/17）RT法測定HIV結果的假陽性率低于ELISA法，RT的特異性高于ELISA試驗。

1.2 抗體確證實驗 由于HIV檢測需要高度的準確性所以初篩并不能保證較高的特異性，還需要進一步的確證實驗，包括免疫印跡試驗（WB）、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗（RIPA）及免疫熒光試驗（IFA）等。目前實驗室診斷HIV最常用的確證方法是免疫印跡試驗（WB），由于其靈敏度和特異度較高也是《全國艾滋病檢測技術規范2009版》中首選的確認方法［9］。免疫印記法是將HIV裂解成不同的片段，在凝膠電泳過程中，病毒不同蛋白按分子量的大小順序排列，并轉移到硝酸纖維素膜上，進行特異性抗體孵育后與酶標二抗共同顯色，根據其出現兩條以上的條帶則能夠判定HIV陽性［18］。由于WB法實驗操作步驟較多，對技術要求高可控性不理想，所以作為HIV的首選確證方法仍需要進一步研究。在進行篩查試驗與WB試驗間的關系研究中顯示，HIV抗體復核的468例樣本中，兩種ELISA檢測方法均呈陽性反應的464例，與WB符合率99.13%，所有的確證樣本中，HIV-1抗體特異帶的gp160、gp120、gp41、p24 的出現都在 98.00%以上，研究證明ELISA初篩實驗存在一定假陽性結果，最終判斷還需以確證實驗結果為準［19］。但是即使WB作為應用最廣泛的確證方法也存在漏檢風險［20］，有學者研究發現WB法存在一定錯誤判斷，將僅有包膜蛋白（gp41+gp20/gp160）或 gag+包膜（p24+gp41或gp120/gp160）的部分人群判斷為HIV陽性，假陽性率甚至達到8%［21］。所以目前針對WB檢測可能出現漏檢的問題，多通過初篩4代陽性+3代陽性樣本，WB確證陽性判別HIV感染患者，若4代陽性+3代陰性樣本，WB檢測存在漏檢問題，需要補充核酸試驗確定［22］。 王佑春［23］對于確證試驗的幾種方法進行了比較研究，發現IFA試驗的特異性和敏感性比ELISA試驗更好，并且與WB相比更易操作，IFA法可以作為WB試驗的簡單替代法。

2 HIV抗原檢測

p24抗原是HIV-1的核心蛋白，在HIV入侵人體后p24的發生水平能夠隨病毒的復制而發展，所以HIV-1 p24抗原能夠在患者早期樣本中檢測出來，檢測時間早于HIV抗體，因此將p24抗原的檢測用于早期感染，目的縮短窗口期［24］。p24能夠在感染后約2～3周內檢出，但隨著抗體的中和作用，游離性抗原減少，此時對于抗原檢測會出現一定程度的影響，機體此時進入無癥狀感染期。疾病后期p24抗原水平會隨著病毒的復制再次增強，所以p24抗原檢測可以作為HIV的早期診斷方法，監測其濃度變化可以反映病情進展［25］。對于HIV-1 p24的抗原檢測主要有ELISA、放射免疫分析、IFA等技術。通常ELISA法是檢測p24抗原的有效手段，但是也存在假陽性可能，所以需要進一步確證實驗。楊曉亮等［26］將使用第4代增加了P24抗原檢測系統的ELISA與膠體硒法、WB法的檢測結果進行比較，結果發現第4代ELISA試劑檢測、膠體硒檢測及WB檢測HIV的陽性率分別為0.34%、0.29%及0.27%。第4代ELISA的HIV漏檢率（1.3%）低于膠體硒法（4.9%），而其檢測HIV的假陽性率（0.03%）高于膠體硒試劑（0.01%）。近年來，隨著科學技術的不斷突破，針對抗原檢測的新方法也在應用當中，如免疫復合物裂解檢測法（ICD）、超敏感酶免疫測定法（UEI）、免疫吸附電鏡法（ISEM）、線性免疫酶測定（LIA）、熒光聯結抗原定量法（FLAQ）［27］。 有研究顯示，免疫復合物裂解檢測法目前的敏感性已提高到90%［18］。雖然p24抗原檢測方法的靈敏度得到大幅提高但是還不能代替RNA病毒的測定，還需要進一步的研發。

3 HIV核酸檢測

核酸檢測是目前最敏感的HIV檢測手段，其測定方法大致上分為反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、分支DNA 信號放大系統（bDNA）、核酸序列依賴性擴增（NASBA）和連接酶酶促鏈式反應（LCx）4種。目前臨床上應用的自動PCR檢測系統能夠將PCR擴增過程和檢測限值在單個反應管中進行，避免了實驗過程中的污染［9］。 楊成勇等［21］使用病毒核酸載量法和HIV-1 RNA的巢式反轉錄PCR（nested RTPCR）法與WB方法進行對比，研究結果發現該研究表明對只有 gp160、p24 和 gp160、gp120、p66、p24 的特殊陽性標本和以p24為主的抗體不確定標本需要用RT-PCR或NASBA方法進行核酸檢測，以進一步確認。在不確定標本的鑒定方面，繆禮鋒等［28］將核酸定量方法與血清學方法進行比較，結果發現針對env帶的不確定標本預示有較大的感染風險，尤其是gp160、gp120和gp160、p24兩種帶型，須做進一步的隨訪和鑒別診斷；應當視情況采用核酸方法鑒別診斷；病毒載量檢測是鑒別不確定標本的有效方法。核酸檢測技術能夠進行定性定量的檢測，并且特異性強、靈敏度高，但由于所需的試劑、儀器昂貴，費用高，真正運用到常規檢驗工作中存在一定難度。

4 耐藥性檢測

世界在抗擊艾滋病方面取得了重大進展——在過去的40年里，艾滋病已經奪走了3500萬人的生命。隨著越來越多的人獲得拯救生命的治療，每年的死亡人數都在急劇下降。但也遇到了一些挫折，最明顯的就是耐藥性的增強［29］。HIV-1遺傳變異是HIV-1反轉錄酶（RT）高速率復制發生錯誤的結果，耐藥菌株的產生是由于病毒復制過程中的不完全抑制治療，幾乎臨床上所有的耐藥菌株均來自于藥物的選擇壓力［30］。HIV耐藥性的檢測分為：基因型檢測法，通過DNA序列檢測耐藥性點突變；表型檢測法，通過檢測病毒在多種抗反轉錄病毒藥濃度中的生長能力判斷是目前耐藥性檢測的金標準。李晶等［31］對HIV-1耐藥性基因檢測法在臨床應用中進行評價，結果顯示對HIV-1耐藥性基因型檢測法能有效地監測感染者血漿中耐藥性病毒株的存在，該方法提供的結果準確、可靠。就目前我國臨床治療現狀，王露等［32］發現我國應用抗反轉錄病毒治療的患者中耐藥性的產生已經十分嚴重，尤其是針對NNRTIs的高度耐藥性較為突出，迫切需要應用耐藥性檢測進行指導。

綜上所述，目前，中國的艾滋病疫情呈現幾個顯著特點：一是艾滋病疫情上升幅度進一步減緩，艾滋病綜合防治效果開始顯現；二是性傳播持續成為主要傳播途徑，同性間的傳播，上升速度明顯；三是全國艾滋病總體呈低流行態勢，部分地區疫情嚴重；四是全國艾滋病受影響人群增多，流行模式多樣化。由于時間和成本的限制，在我國有些醫療點或資源有限的環境中進行艾滋病毒診斷會帶來相當大的挑戰。對HIV的檢測，靈敏度及特異度高的分析方法將有助于HIV的早期診斷，避免漏檢，目前，基于核酸的測試是診斷感染后窗口期和血清轉化前最近感染的唯一可靠方法，但這些測試僅適用于裝備精良的實驗室環境。對于更方便快捷，經濟性準確性更高的實驗室檢測方法還需要進一步研究開發。