長鏈非編碼RNA在乳腺癌中的表達研究進展

劉孟雨，錢 軍

乳腺癌是女性最常見的癌癥之一，同時也是導致女性因癌死亡的一個主要原因。隨著早期發現的普及和手術治療、放化療、內分泌治療、分子靶向藥物等綜合治療的開展，乳腺癌患者病死率有所下降，但乳腺癌的復發仍不可避免。因此探究乳腺癌的發生發展過程具有重要意義。該文對lncRNA在乳腺癌的發展、侵襲轉移、治療耐藥及作為標志物等方面進行系統綜述，以期為乳腺癌的診療提供新的方向。

1 長鏈非編碼RNA（lncRNA）概述

約98%的 “垃圾”DNA轉錄為非編碼RNA（ncRNAs）［1］， 非編碼 RNA 家族中的一個重要的成員—長鏈非編碼RNA（lncRNA），它的轉錄長度超過200個核苷酸且它不編碼蛋白質。根據其基因組位置可分為五類：正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、內含子 lncRNA 和基因間 lncRNA［2］。 近年來越來越多研究發現lncRNA在很多生物學進程中扮演者重要的作用。lncRNA的基因調控可以在不同的水平上發揮作用，包括染色質修飾、轉錄、轉錄后處理、mRNA的支架或誘導以及轉錄后信使RNA的調控［3］。盡管lncRNA研究相對較少，lncRNA的臨床應用是一個新興的熱門領域，其作為診斷標志物和治療靶點具有廣泛的前景［4］。

2 促進乳腺癌發展的LncRNA

2.1 LSINCT5 LSINCT5是一種長約2.6 kb的LncRNA，一般位于細胞核內，其基因由RNA聚合酶Ⅲ而不是 RNA 聚合酶Ⅱ轉錄［5，6］。 LSINCT5 在乳腺癌細胞中過表達，在乳腺癌組織中也過表達。如果將LSINCT5基因敲除，乳腺癌細胞的增殖將減少［6］。因此深度研究LSINCT5并抑制其表達可能將會為乳腺癌的診治帶來新的方式。

2.2 LncRNA-Smad7 在小鼠中，LncRNA-Smad7位于Smad7基因的附近，LncRNA-Smad7在乳腺上皮細胞和乳腺癌細胞中的表達抑制了癌細胞的凋亡［7］。TGF-β的抗凋亡作用可能與抑制LncRNA-Smad7的表達有關。相反，異常表達的LncRNASmad7可以對抗TGF-β受體抑制劑誘導的細胞凋亡。LncRNA-Smad7可能僅通過影響細胞凋亡而促使乳腺癌的發生，因為其表達的缺失對TGF-β誘導的上皮-間質-細胞轉化、Smad2磷酸化或Smad7的表達沒有影響。這表明LncRNA-Smad7是乳腺癌的啟動子，但不同于其他啟動子，它只能抑制細胞凋亡，LncRNA-Smad7有待進一步研究。

2.3 NEAT1 NEAT1基因編碼兩種LncRNA亞型，在核旁斑中起重要作用，對RNA的剪接和轉錄起調節作用。NEAT1在包括乳腺癌在內的多種癌癥中作為致癌因子發揮作用，其表達受ERα信號轉導、 miR-449b-5p/c-Met軸和缺氧反應的調節［8］。 研究表明LncRNA NEAT1促進腫瘤的進展。NEAT1通過誘導上皮-間充質轉變（EMT）促進腫瘤侵襲。LncRNA NEAT1可作為乳腺癌新的診斷標志物和治療靶點［9］。 研究顯示［10］，高 NEAT1 表達水平組與低NEAT1表達水平組間OS存在顯著性差異。NEAT1高表達組的OS明顯低于NEAT1低表達組。因此說明NEAT1表達水平的升高與OS降低有關。但是，由于該研究具有局限性，可能需要更大樣本量、多中心和更高質量的研究，以確定較高的NEAT1表達水平和較低的NEAT1表達水平，以進一步確認本研究的發現。

2.4 BANCR LncRNA BRAF調節的LncRNA 1（BANCR）在乳腺癌中的作用尚未闡明。研究發現，BANCR在乳腺癌細胞和組織中過表達，可促進疾病的臨床進展，包括腫瘤大小、淋巴結轉移。BANCR過表達可促進乳腺癌的臨床進展、轉移和增殖，提示乳腺癌患者預后不良。因此，BANCR可能是乳腺癌患者的潛在預后標志物和治療靶點［11］。BRAF激活的非蛋白編碼RNA（BANCR）是一種新的潛在的腫瘤細胞增殖和遷移的調節因子［12］。LncRNA BANCR在乳腺癌中高表達，與患者的預后密切相關。BANCR的下調可抑制MCF-7細胞的增殖、侵襲和轉移能力［13］。

2.5 SNHG12 LncRNA SNHG12已被證明在多種人類癌癥中發揮作用［14］。SNHG12在乳腺癌中的表達機制尚不清楚。SNHG12在三陰性乳癌癌中表達上調，其高表達與腫瘤大小和淋巴結轉移密切相關。機制研究表明，SNHG12是C-MYC的直接轉錄靶點。SNHG12可能會引起三陰性乳腺癌的發生［15］，三陰性乳腺癌治療效果仍不理想，所以SNHG12可能是一個很有前景的治療靶點。

3 抑制乳腺癌發展的LncRNA

3.1 NKILA 最近，有研究［16］報道了一種新的Lnc-RNA（NKILA）。 在 NF-κB 上調下，NKILA 與 NF-κB/IκB結合生成穩定的復合物，從而直接覆蓋IκB的磷酸化結構域。NKILA可以防止炎癥刺激下乳腺上皮細胞中NF-κB的過度激活。在MDA-MB-231（即乳腺癌細胞系）中，NKILA可增強細胞凋亡，減少侵襲。NKILA可能通過抑制NF-κB的活化來阻止乳腺癌的侵襲和轉移。由此可以推斷一些LncRNA抑制乳腺癌的發生和發展。就機制而言，它主要通過抑制乳腺癌細胞增殖、促進乳腺癌細胞凋亡、抑制細胞的侵襲和轉移來抑制乳腺的發生和發展。

3.2 ZFAS1 研究表明，位于乳腺導管和腺泡內的Zfas1在妊娠和哺乳期間表達不同，這與乳腺發育有關。從乳腺上皮細胞中敲除Zfas1后，細胞增殖增強。研究［17］發現Zfas1在乳腺癌組織中的表達低于正常乳腺組織。因此，Zfas1是乳腺癌的強效抑制劑。其在乳腺癌起源中的作用和機制有待進一步研究。

3.3 GAS5 GAS5是另一種可能導致細胞生長停滯和凋亡的LncRNA。與乳腺正常細胞相比，GAS5在乳腺細胞中顯著下調。研究顯示［18］過表達GAS5可增加MCF10A和MCF7（乳腺癌細胞系）在紫外線照射和順鉑作為抗癌藥物的干預下的細胞凋亡率。在某些情況下，乳腺癌細胞系的生長停滯和凋亡可能是由異常表達GAS5引起的。此外，在缺乏營養物質或生長因子誘導的生長停滯的細胞中，GAS5的表達較高，這些細胞對促進細胞凋亡的刺激極為敏感［19］。因此，一些LncRNA可能通過抑制細胞增殖和刺激凋亡來抑制乳腺癌的發生發展。這些LncRNA有望用于參與乳腺癌的干預。

4 LncRNA與乳腺癌治療耐藥

尿路上皮癌相關基因1（UCA1）參與三苯氧胺耐藥，其異常表達與膀胱癌［20］、胃癌［21］、大腸癌［22］和乳腺癌［23］等多種癌癥的耐藥有關。長鏈非編碼RNA-UCA1位于染色體19p13.12中，具有調控細胞增殖、凋亡、侵襲、細胞周期和耐藥等多種功能［24，25］。用RT-PCR方法檢測了54例Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌組織中UCA1的表達，結果顯示UCA1在晚期（Ⅲ～Ⅳ）有較高的表達。在相同的樣品中，使用免疫組織化學方法，在細胞核中也觀察到較高的β-鏈蛋白表達。用異種移植小鼠的腫瘤組織證實了這一發現，當UCA1被過度調節時，通過Western印跡觀察到較高的β-鏈蛋白表達。此外，使用UCA1敲除的體外分析顯示細胞存活和遷移能力降低，并促進三苯氧胺耐藥乳腺癌細胞的凋亡。這些發現表明UCA1的表達通過刺激WNT/β-鏈蛋白信號轉導途徑增強三苯氧胺的耐藥性，從而允許ER的細胞外再分布，因此，抑制WNT途徑或UCA1的表達或可降低三苯氧胺的耐藥性［23］。AKT/mTOR細胞信號通路也參與了UCA1激活的三苯氧胺耐藥途徑。通過免疫印跡法檢測LCC2與LCC9（三苯氧胺耐藥乳腺癌細胞）和MCF-7（三苯氧胺敏感乳腺癌細胞系）中的p-AKT和m-TOR，證實了這一發現。研究者觀察到UCA1在LCC2和LCC9細胞中同時過表達，P-AKT和P-MTOR的表達顯著增加。相反，UCA1沉默顯著降低了LCC2和LCC9細胞中P-AKT和PMTOR的表達。這些結果提示UCA1正向調節AKT/mTOR信號通路，導致三苯氧胺耐藥性的增加［26］。UCA1似乎也與曲妥珠單抗耐藥有關。在抗曲妥珠單抗乳腺癌細胞株SK-BR-3中，siR-NA使該基因沉默，導致曲妥珠單抗誘導的細胞凋亡增加，miR-18a表達上調。這表明，在曲妥珠單抗耐藥細胞中，UCA1上調，miR-18a靶向YAP1（一個與PI3K和MAPK信號轉導上調相關的關鍵蛋白），允許其過表達。然后，需要UCA1/miR-18a/YAP1軸的作用來驗證體內HER2+乳腺癌的模型［27］。迄今為止，lncRNA在抗曲妥珠單抗中的作用尚有待闡明，需要進一步研究以了解其潛在的用途。

Linc-ROR（也稱為 lincRNA-ST8SIA3）在乳腺癌組織中顯著上調，可誘導MDA-MB231細胞EMT表型和EMT標記波形蛋白和神經鈣黏蛋白的表達。通過過表達和shRNA介導敲除實驗，研究者證實，linc-ROR既增強了這些細胞的侵襲能力，又降低了它們對紫杉醇的敏感性［28］。

lncRNA（MAPT-AS1）是 MAPT基因的反義轉錄本，反義轉錄本又編碼TAU蛋白；該蛋白與紫杉醇競爭微管結合，使細胞對其作用產生抗性。研究發現MAPT-AS1在ER陰性乳腺癌中與紫杉醇抗性有關。他們觀察到MAPT-AS1表達也與MAPT表達相關。結果證明其潛在的機制：MAPT-AS1結合MAPT轉錄本并穩定它，從而有助于高TAU水平［29］。

5 LncRNA與乳腺癌侵襲與轉移

5.1 HOTAIR 研究［30］發現 HOTAIR（LncRNA 的一種）在原發性乳腺癌組織中的表達與正常乳腺組織相比有不同程度的增加，而在轉移性乳腺癌中HOTAIR的表達上調達數倍，甚至近2000倍。然而，它在原發腫瘤中的表達并沒有那么高。在原發性乳腺癌組織中，HOTAIR的高表達可作為腫瘤轉移和患者生存的標志［31］。此外，高表達的HOTAIR可能增強乳腺癌細胞的侵襲。體內實驗發現HOTAIR的高表達可促進腫瘤的生長和發生肺轉移。敲除HOTAIR基因可顯著降低乳腺癌細胞的侵襲性。就其機制而言，已發現高表達的HOTAIR可誘導PRC2（一種轉錄抑制劑）和H3K27me3在854個基因位點上結合，這些基因大多被HOTAIR抑制。HOTAIR已被報道為多種惡性腫瘤的生物標志物，但其參與乳腺癌的機制尚不完全清楚。研究表明，乳腺癌細胞中HOTAIR和EZH2的表達較高。此外，HOTAIR的下調或EZH2的沉默可抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，同時促進其凋亡［32］。

5.2 linc-ROR 研究［33］發現 linc-ROR在乳腺癌組織中表達上調，在人乳腺上皮細胞中異常過度表達的linc-ROR誘導了上皮-間實質轉變 （EMT）過程。此外，他們還發現linc-ROR能促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲。這些結果表明，linc-ROR是EMT的重要調節因子，通過調節小RNA分子促進乳腺癌的進展和轉移。另外，相關研究發現linc-ROR作為侵襲性和轉移性乳腺癌的治療靶點的相關性。

6 LncRNA用作生物標志物

6.1 LncRNA用作診斷標志物 研究［34］發現了LncRNA可能在診斷乳腺癌中的得到應用。他們發現，與正常乳腺組織相比，在乳腺癌標本中，lincRNA-BC2和lincRNA-BC5通常上調兩次以上，而lincRNA-BC4和lincRNA-BC5則下調。在乳腺>癌3期，lincRNA-BC4的表達顯著降低，而lincRNABC5的表達顯著升高，并且lincRNA-BC2的表達與淋巴結轉移呈顯著正相關。特別發現許多LncRNA的表達與不同的分子分型高度相關［35］。此外，一些研究表明血清中的LncRNA可用于乳腺癌的診斷。例如，在乳腺癌患者血清中RP11-445H22.4的表達顯著增加。研究者［36］旨在根據LncRNA的表達特征研究預測對三苯氧胺的反應。根據這個特征，雌激素受體陽性乳腺癌患者可以分為高危和低危組。在三苯氧胺治療的高危患者的診斷中，LncRNA特征可能具有臨床意義。因此，某些LncRNA或可用作乳腺癌的診斷標志物。

6.2 LncRNA用作預后標志物 研究［37］發現了一系列LncRNA，可用于區分乳腺癌患者低風險與高風險。LINC00324的高表達與PTPRG-AS1的低表達與長生存期有關。另一項研究表明SPRY4-IT1通過上調ZNF703的表達促進乳腺癌細胞增殖。此外，SPRY4-IT1表達增加與乳腺癌患者較大的腫瘤和較晚的病理分期有關［38］。 因此，SPRY4-IT1是一種新的預后標志物和潛在的治療靶點。HOTAIR在乳腺癌組織中的高表達與較高的侵襲性和轉移有關，提示HOTAIR可能成為預測乳腺癌整體生存期的預后標志物。HOTAIR的表達可獨立預測ER陽性乳腺癌是否轉移。此外，LINC00472在乳腺癌組織中的高表達與乳腺癌細胞侵襲性差和治療效果較好有關［39］。相關臨床和體內研究提示，LINC00472是一種腫瘤抑制劑，在臨床中對判斷預后和預測乳腺癌的治療效果可能存在價值。MALAT1是一種高度保守的LncRNA，在包括乳腺癌在內的多種癌癥中高度表達。體內外研究表明MALAT1可促進三陰性乳腺癌的增殖、發展和轉移。最近一項利用MALAT1反義核苷酸進行基因干預的研究在乳腺癌Luminal-B型小鼠模型中取得了良好的抑制腫瘤發展的效果。這些研究表明MALAT1有望成為乳腺癌預后的新的生物標志物和治療乳腺癌的潛在靶點［40］。

6.3 LncRNA用作預測乳腺癌耐藥和生存的標志物 LncRNA作為預測乳腺癌耐藥和生存的標志物，具有潛在的應用價值。LncRNA BCAR4的過表達對預測雌激素類藥物三苯氧胺的耐藥性是有效的。另一方面，與ER陰性的乳腺癌和正常組織相比，LINC00160和LINC01016在ER陽性乳腺癌中高度表達，這與Luminal-A型乳腺癌患者的整體存活率呈顯著負相關［41］。特殊的乳腺癌亞型可以通過檢測CCAT2是否過度表達，對環磷酰胺輔助化療反應差來鑒定［42］。 最后，有研究［43］表明 LncRNAROR的過度表達與化療耐藥性有關，提示ROR可作為預測化療耐藥的指標。從以上結果可以推斷，某些LncRNA可能成為預測乳腺癌耐藥和生存的標志物。因此，研究者們正在基于對LncRNA的現有認識，從多個角度（主要包括乳腺癌的診斷、預后判斷、耐藥預測和生存期）探索LncRNA的應用。雖然還需要一些時間來將它們付諸實踐，但相信隨著相關研究的深入和廣度的提高，它們的應用將會更多。

綜上所述，近年來，關于lncRNA在腫瘤中的作用的研究越來越得到重視，有些lncRNA的功能及作用機制有了明確的認識，但對大多數的lncRNA的認識還處于起步階段。不同物種間lncRNA保守序列較少，物種間序列差異較大，這使得動物實驗開展比較困難，這進一步加大了lncRNA的研究難度。可喜的是，隨著基因陣列技術和高通量測序技術的發展等研究方法的不斷完善，我們有望發現更多種類的lncRNA，這將會推動lncRNA的研究發展。我們相信，隨著人類對lncRNA研究的深入，lncRNA會對揭示乳腺癌發生發展的機制做出重要的貢獻，有些lncRNA會成為乳腺癌的診斷、系統治療耐藥、判斷預后的生物標志物。