外泌體在糖尿病性潰瘍中作用機制及應用的研究進展

袁佳沁, 宋福晨, 朱美冬, 李 琪, 王星皓, 張 磊

(1. 上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院 血管外科, 上海, 200437;2. 上海中醫藥大學, 上海, 201203)

糖尿病性潰瘍是糖尿病較為嚴重的并發癥，發生率約15%。長期高血糖狀態會損害血管內皮細胞功能，引起神經病變，易伴發感染[1]。臨床治療糖尿病性潰瘍通常采用手術清創、負壓引流及抗感染等方法[2], 但療效欠佳。近年來，外泌體在治療糖尿病及其并發癥中受到廣泛關注。外泌體廣泛存在于體液中，能夠將包含的mRNAs、miRNAs和蛋白質傳遞到靶細胞來調控細胞間的通訊，發揮生物學效應[3], 并參與多種病理生理過程，如腫瘤生長與轉移、炎癥反應與免疫調節等[4]。研究[5- 6]表明，外泌體可以通過促進成纖維細胞增殖、加速血管生成等機制來促進傷口愈合，這為今后防治糖尿病性潰瘍提供新的思路，故本文綜述如下。

1 外泌體介紹

1.1 外泌體的概念和來源

外泌體是最小的細胞外囊泡，大小在40～200 nm, 最初是由Pan等[7]于1983年從綿羊網織紅細胞中分離出來。隨著研究的深入，發現幾乎所有的細胞都能夠分泌外泌體，包括正常上皮細胞[8]、干細胞[9]、腫瘤細胞[10]、肥大細胞[11]、脂肪細胞[12]等。不僅如此，外泌體還廣泛存在于各種體液中，如血漿、尿液、唾液和母乳[13]。

外泌體是通過內體途徑在細胞內產生的。首先，細胞的質膜被內化形成內含體。隨后，蛋白質和RNA(包括lncRNA、mRNA、miRNA和circRNA)通過內含體分選復合物(ESCRT)依賴途徑或ESCRT非依賴途徑選擇性地被裝入多囊體(MVBs)中。最后，一部分多囊體通過與溶酶體結合而降解，而另一些多囊體則借由Rab27介導與質膜相融合，并釋放到細胞外成為外泌體[14]。

1.2 外泌體的特征及功能

外泌體通常具有以下特征: 呈典型的球形或碟形，質膜為脂質雙分子層，含有豐富的膽固醇、鞘磷脂等脂質成分，并攜帶有特異性蛋白質、功能性mRNAs、miRNAs, 甚至DNA。因此，細胞間能夠通過外泌體進行信息交流，并通過影響靶細胞的存活、增殖、遷移和基因表達以及通過重新編程供體細胞行為來調節許多生理和病理過程[15-16], 如免疫反應、腫瘤擴散、基因交換等。最新的研究[17]表明，外泌體還可以作為藥物投遞載體將抗腫瘤藥物針對性地傳遞至腫瘤細胞，從而提高化療效果，減輕副作用。

過去通常將跨膜蛋白(CD9、CD63和CD81)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、主要組織相容性復合體(MHC)和腫瘤易感基因 101 蛋白(TSG101)作為識別外泌體的特異性蛋白。然而，最近的研究[18]認為這些蛋白可能并不那么具有特異性。最近的一項研究[19]發現，這些蛋白不僅存在于外泌體中，而且也存在于微囊泡中。Jeppeen等[20]重新評估了外泌體組成，發現非外泌體細胞外囊泡可以通過膜聯蛋白A1和A2鑒定，并確定膜聯蛋白A1是直接從質膜脫落的微泡的特異性標記。故目前對于外泌體的特定蛋白標志物尚未達成共識。

1.3 外泌體的分離和鑒定

目前常用超速離心法、密度梯度離心法、免疫親和法和超濾離心法等分離外泌體[21-22]。超速離心法是分離純化外泌體的“金標準”，通過低速離心與高速離心交替的方式得到大小相近的外泌體。超濾離心法利用不同截留相對分子質量(MWCO)的超濾膜進行選擇性分離。這2種方法操作簡便，獲取量大，缺點在于純度常受到質疑。密度梯度法的條件限制更嚴格，獲得的外泌體純度較高，但操作費時、繁瑣。免疫親和法是用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體孵育后結合，將外泌體吸附并分離出來。最近，微流體分離被認為是一種很具前景的選擇性濃縮外泌體的方法，因其可以從少量液體樣品中快速、準確地分離外泌體[23]。

通常使用電子顯微鏡[24]來觀察外泌體的形態，納米粒子追蹤分析(NTA)檢測外泌體的大小、分布和計數[25], ELISA和Western blot分析外泌體的蛋白質含量和分子譜。以上3種方法相結合可有效地對外泌體進行識別、鑒定。此外，流式細胞術可以通過識別單個外泌體上的標記，有效地識別異質外泌體群體中的癌細胞衍生外泌體[26]。因此，流式細胞術可能是鑒定外泌體的有效方法。

2 外泌體與糖尿病性潰瘍的關系

創面愈合是一個復雜的生理過程，包括炎癥期、增殖期和瘢痕期3個不同但相互重疊的階段[27]。然而，糖尿病可以干擾這一過程，導致潰瘍難以愈合，目前其作用機制尚不清楚。最近的研究[28]發現，間充質干細胞(MSCs)在促進潰瘍創面愈合上展示出巨大的優勢，而MSCs釋放的可溶性介質和旁分泌因子在創面愈合中起著關鍵作用[29]。故外泌體作為重要的旁分泌因子，可以影響創面愈合的多個過程，在糖尿病性潰瘍的修復中具有巨大潛力。

2.1 促進成纖維細胞的增殖和遷移

組織受損后，纖維細胞被招募到損傷部位，通過獲得成纖維細胞樣表型并產生細胞外基質成分和生長因子來促進組織修復。Walker等[30]研究發現，2型糖尿病患者較正常人群的外周血中纖維細胞減少，晚期糖基化終產物(AGEs)濃度增加，氧化應激反應強烈，并釋放更多的促炎細胞因子，這可能是導致糖尿病患者潰瘍創面難愈的原因。間充質干細胞分泌的外泌體具有逆轉這一過程的能力，有助于糖尿病性潰瘍創面愈合。Tao等[31]發現滑膜間充質干細胞(SMSCs)具有較強的促進成纖維細胞增殖的能力。同時，該團隊[32]證實了富血小板血漿衍生外泌體(PRP-Exos)能促進糖尿病大鼠模型慢性潰瘍創面微血管內皮細胞(HMEC-1)和成纖維細胞的增殖和遷移，并釋放堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、人血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)、血管內皮生長因子(VEGF)和轉化生長因子-β(TFG-β)等生長因子。同時, Shabbir A等[33]研究也證明了骨髓間充質干細胞外泌體(BMMSCs-Exos)具有促進成纖維細胞的增殖和遷移的作用，并且外泌體可以激活傷口愈合[蛋白激酶B(AKT)、細胞外調節蛋白激酶(ERK)和信號傳導及轉錄激活因子(STAT3)等]中的幾種重要信號通路，誘導干細胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、神經生長因子(NGF)、趨化因子基質細胞衍生因子-1(SDF-1)等多種生長因子的表達。

Geiger等[34]提取人的循環纖維細胞，并用PDGF-BB 和TGF-β1刺激纖維細胞衍生外泌體。結果證實其具有促進血管生成，誘導糖尿病皮膚成纖維細胞、角質形成細胞的遷移和增殖，并加速2型糖尿病小鼠創面愈合的功能。進一步研究發現，該外泌體中含有多種有效成分，如成血管相關的mir-126、mir-130a、mir-132, 抗炎相關的mir-124a、mir-125b, 以及調節膠原形成的miR-21, 進一步從分子層面解釋了外泌體促進糖尿病潰瘍創面愈合的機制。

2.2 促進血管生成

血管生成是決定糖尿病性潰瘍愈合結果的關鍵因素[35], 具有極其重要的生理學作用。目前較多文獻證實了間充質干細胞及內皮祖細胞分泌的外泌體可以促進血管的生成，從而加速糖尿病性潰瘍創面的愈合。

Tao等[31]在糖尿病大鼠體外實驗中發現mir-126-3p過度表達的SMSCs-Exos可促進血管生成，加速再上皮化和體內膠原成熟，表明了SMSC-126外泌體能夠加速糖尿病性潰瘍創面愈合。Guo等[32]發現PRP-Exos可能通過激活ERK和Akt信號通路參與誘導血管生成。Dalirfardouei等[36]發現經血源性間充質干細胞外泌體(MenSCs-Exos)可以通過上調血管內皮生長因子A促進新生血管的形成。Chen等[37]發現人尿源干細胞外泌體(USC-Exos)中富含一種叫做DMBT1的促血管生成蛋白，是促進內皮細胞血管生成和創面愈合的必需物質，故USC-Exos可以通過轉移DMBT1蛋白來促進血管生成，加速潰瘍愈合。

內皮祖細胞(EPCs)是血管內皮細胞的前體細胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓中動員到外周血液參與血管損傷的修復。有研究[38-39]發現，內皮祖細胞來源的外泌體能夠促進血管內皮細胞的增殖、遷移能力，提高VEGF、人低氧誘導因子1α(HIF-1α)等因子表達，加速糖尿病大鼠模型潰瘍創面的愈合。Zhang等[40]發現內皮祖細胞源性的外泌體可以影響在成血管中有重要作用的ERK1/2通路，調節相關蛋白的表達促進糖尿病性潰瘍創面的修復與再生。Li等[41]研究結果表明，脂肪間充質干細胞源性的外泌體(ADSCs-Exos)能夠促進EPCs的增殖和血管生成，促進肉芽組織形成和生長因子表達以及降低炎癥和氧化應激相關蛋白水平，從而顯著減少糖尿病大鼠足部潰瘍面積。上述研究均表明來自間充質干細胞源性的外泌體能夠調節內皮祖細胞的功能，促進潰瘍創面愈合。

2.3 調控炎性因子

在糖尿病患者中，潰瘍創面局部的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)等表達明顯升高，已有較多研究發現外泌體可以通過調節損傷局部的炎癥反應來促進皮膚的修復。

Li等[42]發現人臍帶間充質干細胞外泌體(hucMSCs-Exos)在糖尿病大鼠燒傷模型中可以抑制炎癥反應，降低TNF-α、IL-1β的表達，促進抗炎因子IL-10的表達。外泌體所含的miR-181c過表達可以有效減少炎性因子分泌，抑制TLR-4信號通路，減少NF-κB/p65的通路激活，抑制炎癥反應。有研究[36]也發現MenSCs-Exos通過NF-κB/p65亞單位上調和激活NF-κB信號通路誘導M1-M2巨噬細胞極化來減輕炎癥。

Ti等[43]評估了骨髓間充質干細胞的外泌體(LPS pre-Exo)對糖尿病慢性炎癥和創面愈合的治療效果，發現其上調抗炎細胞因子的表達和促進M2巨噬細胞活化，激活let-7b/TLR4通路，促進慢性炎癥消退，加速糖尿病潰瘍創面的愈合。因此，外泌體調節炎癥反應可能是通過激活NF-κB/p65、let-7b/TLR4通路，降低炎性因子TNF-α、IL-1β等的表達和誘導巨噬細胞活化來實現的。

2.4 對糖尿病周圍神經病變的影響

糖尿病性潰瘍創面與普通創面的另一區別在高糖環境會導致周圍神經病變的發生，神經傳導速度變慢，皮膚感覺減退，失去原有的保護作用，不利于創面的愈合。Jia等[44]發現在體外實驗中，用高糖外泌體處理遠端軸突后導致軸突生長減少，這與軸突中miR-28、miR-31a和miR-130a的升高以及它們的靶蛋白DNA甲基轉移酶-3a、Numb、突觸體相關蛋白25和生長相關蛋白43的減少有關，而體內實驗顯示高糖外泌體作用于小鼠坐骨神經可誘導周圍神經病變的發生。這一結果提示了來源于高糖刺激的施旺細胞的外泌體在介導糖尿病周圍神經病變的發展中起到了一定的作用。

另一方面，MSCs-Exos能夠介導受損神經元組織的功能修復。有研究[45]發現MSCs可以通過傳遞外泌體轉運miR-133a以促進軸突重塑和神經元生長，改善受損神經元組織的功能。因此，外泌體作為細胞通訊的媒介，可以雙向調控糖尿病周圍神經病變的發生、發展，提供了一種新的治療思路。

2.5 外泌體在糖尿病性潰瘍中的應用

在最新的文獻報道中，有學者將外泌體與別的介質相融合形成藥物材料，并將其應用于糖尿病性潰瘍創面的損傷修復中，以評價其作用效果，開創了一種無細胞、無創的治療方案。

Wang C等[46]發明了一種FHE@exo復合水凝膠，是將AMSCs-exo搭載到FHE水凝膠上，具有加速愈合、剪切稀化、高效抗菌、不受pH影響且釋放具有生物活性的外泌體等多種功能，可協同促進潰瘍愈合和皮膚再生。Xu N等[47]從莪術根莖中成功分離純化了一種均一多糖(ZWP), 并將其結合到負載富血小板血漿外泌體的殼聚糖/絲水凝膠海綿上形成PRP-Exos/ZWP。Shi Q等[48]分離來自牙齦間充質干細胞(GMSCs)的外泌體，然后將其負載到殼聚糖/絲質水凝膠海綿上，以評估這種新的非侵入性方法對糖尿病大鼠潰瘍的影響。上述2項實驗均發現外泌體復合物材料能夠通過促進膠原的再上皮化、沉積和重塑，促進血管生成和神經元的內向生長，從而有效地促進糖尿病大鼠潰瘍創面愈合。以上這些發現為糖尿病性潰瘍修復提供了一種新的外泌體介導的臨床治療方法。

3 總結與展望

外泌體是一類納米級的細胞外囊泡，隨著對其生物特性和功能的深入研究，發現其可以介導細胞間通訊，調控生理及病理活動，并具有一定的治療價值。本研究總結了外泌體有助于糖尿病潰瘍創面愈合的作用機制包括促進成纖維細胞的增殖和遷移、刺激血管生成，調控炎癥反應、分泌生長因子和加速膠原合成，以及改善糖尿病神經病變等。故而提供了一種全新的治療糖尿病性潰瘍的思路，具有廣闊的前景。最新的研究方向顯示了外泌體還可以被設計為載體，運載藥物或RNA進入靶細胞，以實現精準定位，用于靶向治療，開辟了修復糖尿病性潰瘍的一種無細胞、無創性的治療方法。

然而，目前將外泌體應用于治療糖尿病性潰瘍仍然存在一些問題，包括如何高效制備和分離高純度的外泌體，以及無法分離不同細胞釋放的特定外泌體。未來的研究應著眼于開發更有效地分離提純方法，以解決上述這些問題。此外，外泌體促進糖尿病性潰瘍愈合的具體機制以及如何將其更好地應用于臨床中仍有待于進一步探索。相信在不久的將來，研究者對外泌體會有進一步的認識，并在治療糖尿病性潰瘍中得到越來越多的應用。