非病毒載體介導的基因治療在骨缺損修復中的研究進展

任超 周諾

廣西醫科大學附屬口腔醫院，廣西口腔頜面修復與重建研究自治區級重點實驗室，廣西顱頜面畸形臨床醫學研究中心，頜面外科疾病診治研究重點實驗室（南寧530021）

隨著社會經濟發展，由各種先天性、感染、創傷、惡性腫瘤和骨折引起的骨畸形和骨缺損的數量在逐年增加。骨組織有一種獨特的自我修復能力。然而，在一些臨床病例中，人體無法再生骨導致愈合受損，臨床中不能愈合的骨缺損主要由自體骨、異體骨和骨移植替代物來填補。同種異體骨移植有潛在疾病傳播的風險，而臨床自體骨移植治療又有造成供體部位疼痛和缺損、手術時間過長和可供組織量有限等局限性以及骨生長因子在體內半衰期短的問題。基因治療可能是骨缺損的替代療法，使用基因載體將生長因子傳遞到骨缺損部位，靶基因可持續和潛在可調控地誘導產生的內源性骨形成蛋白較外源重組蛋白生物利用度高，內源性生長因子通過在局部的表達來促進損傷部位的修復和再生，轉基因技術聯合干細胞工程修復骨的缺損擁有著不可估量的應用價值和發展前景。然而目前大量的實驗研究還僅局限于動物實驗，因此，在轉化為臨床實踐之前，必須開發可靠且有特異性的基因載體系統并評估其功效和安全性。基因載體可根據其來源分為兩大類：病毒載體和非病毒載體。非病毒載體因其具有低免疫原性、成本低廉、制備簡便、基因攜帶量大等優點而成為研究的熱門領域［1］。本文簡要回顧了非病毒載體的生物學特性及其在骨缺損修復領域體內體外實驗的研究進展。

1 非病毒載體的生物學特點及發展

通常用于基因治療的病毒載體包括經過修飾了的慢病毒、腺病毒、腺相關病毒等。由于病毒載體與野生病毒一樣對體細胞易感，因此其轉染效率較高，但仍存在許多難以克服的缺陷。病毒載體可攜帶的目的基因通常受野生型病毒基因組大小的限制，其次，病毒載體制備復雜，有較嚴格的儲存運輸要求，成本高，最重要的是安全問題，所攜帶的基因序列有可能重組入宿主基因組，有致癌風險以及免疫原性［2］。與病毒載體不同，非病毒載體具有優異的生物安全性，低毒性、低免疫原性、外源基因的低整合率，除此以外，攜帶基因的容量大，制備簡單，易于保存和測試的優勢使其在基因治療領域有著巨大的應用潛能，然而，限制其被廣泛使用的最重要因素是低轉染效率［1］。所有基因載體系統成功實現轉染必須順利完成核酸被遞送至干細胞、細胞穿過細胞膜屏障、逃避內吞作用和溶酶體、基因與載體解離并進入核屏障四個階段［3］。隨著科學技術的發展以及對基因載體系統轉運機制研究的深入，許多經過不斷地優化后能夠滿足臨床高效安全要求的非病毒載體被研制出來。目前，臨床試驗中常用的非病毒載體有脂質體或脂類復合物、陽離子多聚復合物、多肽蛋白類、細胞穿透肽、納米材料遞送系統等。在基因增強骨組織工程中研究應用較多的是脂質體和陽離子聚合物。

1.1 脂質體及脂質體復合物 脂質體是通過在水中疏水締合的磷脂的有序排列的組合體，并且封閉的微膠囊由一個或多個脂質樣雙層膜形成，其特殊的結構使脂質體具有低毒性、優異的生物相容性、可降解性、較大的目的基因包裝能力、易于制備和改性等優點，同時，當DNA 等包封到人體內時，可以防止DNA 被核酸酶降解，并且促進內體的逃逸以有效輔助基因轉移［4］。FELGNER 等［5］在1987年首次使用陽離子脂質（DOTMA）作為基因轉移載體。對脂質體的研究發展至今，脂質體可根據性能分為多種類型：一般脂質體、光敏脂質體、熱敏脂質體、pH 敏感性脂質體和磁性脂質體等。根據電荷的性質，脂質體將分為陽離子脂質體、中性脂質體和陰離子脂質體。

陽離子脂質體是當前最常使用的非病毒基因傳遞載體。研究者們為改良陽離子脂質體低轉染效率和靶向性的問題使用了眾多方法，包括添加輔助性材料、對脂質體表面進行結構性修飾、研發設計新型脂質材料、創新制備工藝等。一些學者在脂質體表面進行了聚乙二醇（PEG）-脂質修飾，PEG 化脂質體的理化性質更穩定，降低了對單核巨噬細胞系統的識別攝取［6］。還有研究者從食品級油脂中提取的脂肪酸混合物（如棕櫚烯脂）制備陽離子脂納米載體系統（ps-lip）［7］，因為食品級的棕櫚酰甘油（三酰基甘油）含有肉豆蔻酰（C14）到亞油酸（C18：2）的鏈長，鏈長變化小，組成均勻穩定，增強了對附著及懸浮細胞的轉染效率，對于核酸的傳遞和基因編輯更有效、更經濟、更安全。制備陽離子脂質體的常規方法包括反向蒸發法、鈣融合法、凍融法和洗滌劑法等。近年來許多新的生產技術被研發出來以提高脂質體的轉染效率，有高壓均質化方法，優化的乙醇注入方法，真空干燥-超聲方法，膜-凍融方法，SUV-融合方法等［8］。陽離子脂質體的轉染效率不僅與陽離子脂質體的結構有關，而且與載體跟DNA 的比值密切相關。HAN 等［9］在研究非病毒轉染技術中得到最佳轉染效率的陽離子脂質體：DNA 用量比例為0.3 μL：80 ng。

1.2 多聚物載體 聚-L-賴氨酸（PLL）［10］是第一種用于體內基因轉染的聚合物，隨后許多陽離子聚合物作為體外和體內基因載體迅速發展起來，合成型陽離子聚合物包括多聚賴氨酸、聚氨酯、聚乙烯甲胺陽離子共聚物、聚磷腈類；天然生物陽離子聚合物有殼聚糖、環糊精及其衍生物。陽離子聚合物具有優異的DNA 結合和保護作用，并具有優異的生物相容性，生物安全性和易于進行化學修飾的優點使其在未來基因治療領域有著無限的應用價值。多聚物的特點是可以利用復雜的分子結構形成獨特的構象，從而大大提高載體穩定性和外源基因的緩釋效果，多聚物上的多種官能基團能通過靜電或共價鍵等方式易于被修飾而改性。

1.2.1 聚乙烯亞胺（PEI） PEI 是近年來發展最快的基因載體之一。作為化學原料，PEI使用范圍廣，價格低廉，來源廣泛。1985年，BOUSSIF 等［11］發現PEI 具有基因轉載的作用。PEI 能作為基因轉染載體是由于其氨基含量較高，在生物環境下能夠發生“質子海綿”效應，可讓復合物從內涵體中逃逸順利入核［12］。隨后國內外眾多學者對PEI 載體轉運機制進一步的研究得出影響PEI 復合物轉染效率的因素有PEI 的相對分子質量、表面電荷密度、PEI 的氨基與DNA 的磷酸基的比（N/P）、復合物的粒徑等。王清富［13］的實驗結果證實，轉染效率隨著N/P 值的增加而增加，獲得最大轉染效率的N/P 為6，為優化PEI 傳遞系統和研制新型載體提供理論支持。

PEI 的轉染率和細胞毒性與PEI 的分子量成正比，因此在使用PEI 作為轉染試劑之前，應考慮轉染效率和細胞毒性的分子量和濃度之間的平衡。許多研究人員使用特殊基團修飾PEI，如雙氨基甲酸酯鍵、惰性可降解聚合物等用于連接低分子量PEI 以通過交聯或鏈延長獲得高分子量可降解聚合物，從而達到增強其特異性和穩定性，降低毒性，提高轉染效率的作用。PENG 等［14］則分別利用環糊精和殼聚糖交聯小分子PEI 來提高其分子量，既能夠達到一定轉染效率，也保存了小分子PEI 生物毒性低的優點。HUANG 等［15］首次提出了一種超分子策略，即用大環葫蘆［7］脲（CB［7］）包裹大分子量PEI（分枝，25 kDa），轉染效率高，PEI 的細胞毒性被顯著抑制，是一種有效的非病毒基因傳遞載體。該策略為降低PEI 和其他陽離子基因載體非特異性毒性提供了新的見解。近年來，有研究者打破了“效率-毒性”悖論，LIU 等［16］通過鋅（Zn）對陽離子聚合物（LCPs）的協同修飾，可以同時實現高轉染效率和低分子量（降低細胞毒性）。

PEI 的毒性與其較高的表面電荷密度有關，降低陽離子聚合物細胞毒性的另一種方法是添加一個親水層來掩蓋表面的正電荷，比如PEG［17］、普朗尼克［18］、葡聚糖［19］等。憑借靜電力的相互作用，PEI 與DNA 形成的復合物表面電荷密度和載體的毒性均較PEI 低。有許多報道認為PEI 的內體緩沖能力與基因轉移效率無關，膜分解同樣具有細胞毒性，細胞質內DNA 也面臨被降解等風險，故有研究者［20］構建組蛋白（H3）修飾PEI，H3 避開了溶酶體轉運而是利用其效應器和Rab6 GTPase 調控的逆行通路，它極大地提高了將聚合物輸送到細胞核中的效率，同時降低了細胞毒性。改進的靶向細胞核的策略對于促進基因治療在再生醫學和許多其他疾病中的發展至關重要。

1.2.2 殼聚糖（CS） CS 是一種無生物毒性多糖，是通過甲殼素的脫乙酰化形成由β-（1，4）糖苷鍵連接的D-葡糖胺和N-乙酰基-D-葡萄糖胺亞基組成的聚合物。在1995年MUMPER 等［21］是使用殼聚糖作為基因轉移載體的第一位學者。研究發現殼聚糖和帶負電荷的DNA 通過靜電力形成復合顆粒，并且顆粒可以順利地穿透細胞膜并完成基因治療。盡管殼聚糖的轉染率低，但由于其無與倫比的安全性和優異的生物相容性和生物降解性引起了廣泛的關注。

影響殼聚糖的轉染效率的因素包括其自身的結構如分子量、脫乙酰度、殼聚糖／DNA 復合物的氮磷比（N/P）、粒徑和運輸條件如pH、細胞類型等。研究證實，殼聚糖分子量越高，保護細胞外DNA 能力越強，用于高效基因轉染的最佳pH 值為6.8～7.0，最佳電荷比在3～5，最佳血清濃度為10～20 wt%［22］，除此之外，中度脫乙酰的殼聚糖轉染效率更高［23］。明確了殼聚糖最佳轉染條件后，為其之后的優化改性提供了科學的理論基礎。殼聚糖易于被改性，可以通過制備衍生物或復合其他材料以提高轉染效率。許多研究人員通過增加殼聚糖的電荷密度來提高殼聚巧的轉染效率，例如，通過殼聚糖末端胺的N-季銨化來增加電荷密度［24］；用PEG 修飾殼聚糖聚合物［25］；用高電荷密度PEI 接枝改性［26］等。林福星［24］創新性地使用含磷化合物，通過輻射接枝技術制備聚苯乙烯膦鹽接枝殼聚糖的復合物（CS-P），基因轉染效率從4.59%提高到32.8%。還有研究［27］發現3-D 礦化藻酸鹽殼聚糖微膠囊是一種低毒性的，具有生物學和實用價值的非病毒基因載體，與許多其他的非病毒載體系統相比，在轉染原代骨細胞中具有較高的轉染效率。

2 非病毒載體在骨修復領域的研究

隨著分子生物學的不斷發展和骨創傷愈合機制研究的深入，通過轉基因技術，利用非病毒載體介導內源性或外源性的生長因子來促進新骨形成和修復骨組織缺損已成為國內外前沿研究的熱點。在促進新骨的生長重建和骨缺損的修復的復雜過程中，各種細胞及生長因子在各個階段均起到了重要的作用，細胞因子之間相互作用，對激素的分泌以及對細胞的代謝均起到調控作用。生長因子包括轉化生長因子-β（TGF-β）、骨形態發生蛋白（BMP）、酸性和堿性成纖維細胞生長因子（FGF）、胰島素樣生長因子（IGF-1）和血管內皮生長因子（VEGF）等［28］。

2.1 基于體外基因傳遞的骨再生工程 科學研究已經廣泛證實了BMP-2 是誘導胚胎骨生長和成人骨修復的重要生長因子。Lip2000 是已實現商品化的非病毒載體，具有低毒、高效、操作簡便、價格優廉等優點，已廣泛應用于基因治療上。方志輝等［29］利用Lip2000 成功將BMP2 基因載入大鼠的BMSCs 中，誘導其向成骨細胞分化，促進骨小梁形成并縮短了骨折愈合的時間。骨缺損修復是由多種細胞及生長因子共同參與完成的，因此許多研究者通過非病毒載體攜帶多基因轉染干細胞實現共表達，更好的模擬了體內生理過程。一些研究人員［30］使用陽離子脂質體作為載體，體外轉染干細胞實驗表明，BMP2 和VEGF165 聯合基因以及IGF1 和BMP2 聯合基因在骨再生中均具有良好的協同效應，外源性基因均得到穩定表達，陽離子脂質體作為非病毒載體其低毒性、出色的生物相容性、較大的DNA 包裝能力等出色的優點。FGF-2 和BMP-2 在PEI 遞送下共轉染人脂肪來源的間充質干細胞（hADMSCs）也表現協同促進成骨分化作用［31］。

研究者們為了優化陽離子脂質體的性能，許多經過結構性修飾或新研發的類脂質體較傳統脂質體在體外成骨實驗研究中獲得了較高轉染效率以及較低的細胞毒性。GAO 等［32］從［12］-aneN3 中提取陽離子脂質并分別用由萘酰亞胺（1a）、油酸（1b）和十八胺（1c）進行修飾，3 個傳遞系統均對成骨細胞MC3T3-E1，MG63，HeLa 和HEK293 細胞均表現出良好的轉染效率，其中1a 的轉染效率比lipofectamine 2000 更高，除此之外它還成功通過非侵入性熒光成像對細胞攝取，DNA 轉運和釋放進行原位監測。因此，筆者得出結論，1a 作為多功能非病毒傳遞系統，用于治療未來成骨細胞相關的各種骨疾病可能是一個有前途的非病毒基因載體。ATTIA 的研究團隊［33］以陽離子脂質體2，3-二（十四氧基）丙烷-1-胺為基礎并結合聚山梨醇酯80開發了一種新的類脂質體載體系統，將BMP-7 基因轉染間充質干細胞（MSCs），轉染后細胞增殖活性、ALP 活性顯著增強，細胞外基質沉積，證明了他們設計的非病毒載體可以有效的用傳遞BMP-7，促進新骨再生，為開發新的高性能基因載體提供了進一步的思路。陽離子脂質體作為基因轉染的載體在體外的研究應用已趨于成熟，為今后開展體內實驗研究以及骨缺損修復的臨床應用奠定基礎。

除此以外，還有許多新型非病毒載體經過體外實驗驗證，同樣能高效地傳遞基因入靶細胞并穩定地表達蛋白。由CHEN 等［34］設計的新型非病毒基因載體PAA-BA 在轉染BMSCs 后顯示出成骨分化潛能的增強，這些發現表明基于PAA-BA 的基因遞送載體可以維持BMSCs 的干細胞特征，PAA-BA 具有更好的細胞相容性與安全性。還有研究者38 開發了一種用聚合物pDNA 納米復合物涂覆鈦表面以增強骨整合的新方法，筆者發現，以N/P 比率為10 制備的涂有PEI-pDNA（BMP-2）納米復合物的圓盤體外轉染BMSCs后可有75%的細胞活力和14%的轉染效率，與對照組相比，成骨標志物的表達較強，并有明顯的鈣沉積，突出了非病毒載體與基因活化的鈦表面結合后具有增強骨整合的潛力。由于microRNA 在骨再生中穩定性差、細胞攝取低，低免疫原性，WU 等［35］制備了殼聚糖/三聚磷酸鹽/透明質酸納米顆粒（CTH NPs），CTH NPs 在向骨髓間充質干細胞遞送抗mir-138 方面顯示出高效率和無毒性，且有較強的骨再生能力。這些研究提示了非病毒載體用于基于BMSCs的基因治療的潛能，特別是骨相關疾病，為開發新型高效基因傳遞系統提供了進一步的見地。

2.2 基于體內基因傳遞的骨再生工程 局部基因治療具有通過將成骨基因局部遞送至骨病變區持續地指導受調蛋白質表達來增強骨缺損愈合和骨再生的潛力。基因激活基質（GAM）是由質粒DNA 和可生物降解的生物材料作為載體組成的惰性支架系統，通過聚合物支架將質粒DNA轉移至靶細胞，已被廣泛用于組織工程學研究。GAM 具有眾多優點，如低免疫原性，可以避免將載體分布到其他組織中，高生物降解潛力和易于大規模生產等。成骨基因與生物相容性支架的結合極大地加速了骨愈合。D′MELLO 等［36］開發并評估了一個新的非病毒基因遞送系統的體內骨再生的能力，利用膠原支架傳遞聚乙烯亞胺（PEI）-質粒DNA（pDNA）復合物至大鼠顱骨缺損中，植入體內后檢測新骨量/總體積（BV/TV）%非病毒PEI-pPDGF-B 復合物、PEI-pVEGF-B 復合物負載的支架明顯高于空支架，其中PEI-（pPDGF-B+pVEGF）復合材料促進大鼠顱骨缺損的成骨效果最優，并顯示出更高的組織再生效率和低細胞毒性及低免疫原性。基于之前大量研究證明多種細胞因子有協同成骨的作用，KHORSAND 等［37］在糖尿病兔骨干長骨徑向缺損模型中植入負載有PEI-（pBMP-2 + pFGF-2）復合物的膠原支架，在BMP-2 和FGF-2 的協同作用下骨缺損處有大量新骨再生，因此載有PEI-（pBMP-2 + pFGF-2）的支架可能是促進糖尿病患者骨缺損修復的有效方法，具有巨大的臨床應用潛力。還有研究發現載有含編碼成骨蛋白的cmRNA 的非病毒載體支架的高轉染效率，低細胞毒性和體內成骨潛能而被認為可能是促進骨再生的有效工具［38］。這些研究為未來臨床應用非病毒基因載體治療各種原因所致的骨缺損修復的可行性和有效性提供了理論基礎。

宿主細胞的高轉染效率和安全性是體內有效基因轉染所必需的。許多研究者開發并評估了用于體內骨再生的組合非病毒基因載體的可行性和有效性。趙亮［26］采用共價交聯法制備的CS-PEI/hBMP-2 納米粒子在體外能有效轉染MC3T3-E1 細胞并具有促進細胞增殖、誘導MC3T3-E1細胞分化的能力，將CS-PEI/hBMP-2 復合至明膠海綿支架上，植入到大鼠顱骨骨缺損處12 周后通過Micro CT 及組織學染色觀察結果表明CSPEI/hBMP-2 納米粒子能促進新骨形成，并且沒有明顯的體內毒性。YUE 等［39］也通過實驗驗證了CS-PEI/hBMP-2 具有體內外促進成骨分化的能力，促進骨組織分化，修復骨缺損。CS-PEI 在轉染效率和生物安全性方面均優于PEI 和Lipofectamine，是一種很有前途的非病毒載體，在干細胞基因治療中擁有廣闊的應用前景。除此之外，nGO-PEG-PEI 因其較高的siRNA 傳遞效率和持續的靶基因沉默而被認為可能是一種有前途的siRNA 載體，研究者通過制備納米級的PEG 和PEI 雙功能化氧化石墨烯（GO；nGO-PEG-PEI），再通過陽極氧化法制備的二氧化鈦納米管（NTs）經陰極電沉積，用nGO-PEG-PEI/siRNA對其進行生物氧化得到NT-GPP/siRNA，NT-GPP/siCkip-1 顯著改善了MC3T3-E1 細胞的體外成骨分化，增加了ALP 的產生、膠原分泌和ECM 礦化，可明顯增強體內骨整合，改善了成骨相關基因表達［40］。因此筆者認為，組合非病毒基因載體應用于體內骨缺損修復是可行并且有效的，它集多種非病毒載體的特性于一身，作為一種新型非病毒載體系統，在口腔及整形外科的臨床應用有很大的潛力。另有一種小核酸傳遞系統是由成骨細胞靶向肽（SDSSD）修飾的聚氨酯（PU）納米微粒，它封裝siRNA/microRNA，能有效將藥物靶向傳遞給成骨細胞且在體內不會產生明顯的毒性或引起免疫反應，可作為一種成骨細胞誘導的骨合成代謝病的治療方法。

雖然國內外已有大量基因治療的實驗研究，但是迄今為止，尚未開發出在臨床上能廣泛應用于骨再生領域的基因載體。基于生長因子的基因治療的主要限制是大型動物研究不足，將這些研究轉化為人類臨床實踐仍然是一個巨大的挑戰。眾學者在非病毒載體介導的基因治療在體內外成骨、修復骨缺損方面的研究結果均有積極的意義，為進一步將基因治療的體外實驗轉為體內臨床應用提供了有價值的信息。

3 問題與展望

隨著骨再生和骨修復生物學研究的深入，基因轉染的載體的性能、基因轉移技術及基因治療方法的不斷優化，將基因治療與骨組織工程相結合，利用誘導因子以持續性而可控的方式刺激內源性生長因子合成來促進骨缺損區新骨形成，基因傳遞比直接高劑量蛋白質遞送更具成本效益，已然成為骨組織工程未來的發展方向。然而大多數實驗仍局限在體外和小型動物實驗階段，除此之外，監管義務不到位，財政支持的限制，安全問題和基因傳遞方式的局限性也是將基因治療納入臨床考慮的主要限制。因此，在轉化為臨床實踐之前，開發出可靠的、可復制的基因傳遞方法與有效性和安全性得到保證的合適載體是我們目前共同追尋的目標，這也是未來開展基因治療最艱巨的任務。

基因治療是一個相對較新的醫學領域，安全是首要考慮因素，在設計基因治療的載體時筆者要考慮幾個方面，盡量最小化DNA 在宿主基因組中的插入以避免突變的發生；優化傳遞方法以防止血液或組織中DNA 被降解；生產過程中保證載體結構的質量，將毒性降至最低。轉化為臨床應用時還需要考慮實際因素，例如患者的年齡、性別、系統性健康狀況以及骨性疾病的性質，使基因治療個性化。理想的基因載體還應該對靶細胞高度特異且生產、儲存、運輸成本適宜。

非病毒載體具有生物毒性低，免疫原性低，基因容量大，外源基因整合率低的優點，為其臨床的應用提供了更多可能性，以及制備簡單、便于大規模生產、使用方便、靶向性好、易于保存和檢驗等優點，因此具有很大的發展空間，是未來基因攜帶者的主導方向。但非病毒載體體內轉染效率和轉基因表達持續時間較病毒載體低，這將是非病毒型基因載體臨床應用受到限制主要因素。相信隨著基因載體復合物的細胞內轉化及細胞內部轉運機制的深入研究，將會有越來越多的全新的非病毒基因載體出現，非病毒載體介導的基因治療在骨缺損修復領域將會取得更多的研究成果。