骨髓間充質干細胞旁分泌HGF體外調控肝星狀細胞

李靜，鄭雪，丁新，向輝，陳衛剛

肝臟疾病是我國常見病、多發病，肝硬化和肝癌是肝臟疾病重要的致死原因。肝纖維化是肝硬化和肝癌的中間環節，而抑制肝星狀細胞的激活和增殖是緩解肝纖維化的策略之一。骨髓間充質干細胞（BMSCs）是骨髓中的非造血組織，因具有自我更新、多向分化、免疫抑制等功能而成為臨床研究熱點［1］。現越來越多的動物實驗及臨床試驗表明BMSCs可治療骨或軟骨損傷、心臟疾病、中樞神經系統損傷、脊髓損傷［2］。近年來，BMSCs在肝纖維化方面的治療也取得了一定的進展［3］，但其具體機制還不明確。本實驗將骨髓間充質干細胞與肝星狀細胞（HSCs）建立間接共培養體系，初步探討骨髓間充質干細胞緩解肝纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級SD雄性大鼠，體質量120～180 g，購自新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心；大鼠肝星狀細胞（上海富衡生物科技有限公司）；胎牛血清（美國BI公司）、L-DMEM培養基（美國Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone公司），CD29-FITC抗體、CD45-FITC抗體、CD90-PE抗體（eBioscience公司）；MTT（Solarbio公司）；肝細胞生長因子ELISA試劑盒（中國Elabscience公司）；c-met抗體（MCE公司）；兔抗α-肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（ab32575，Abcam公司）；熒光二抗（山羊抗兔IgG-FITC，北京中杉金橋生物科技有限公司）；PI（美國Sigma公司）；Transwell insert半透膜（0.4μm，美國Corning Costar公司）；Annexin V-PE細胞凋亡試劑盒（中國聯科生物公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；酶標儀（美國BIO-RAD公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞的提取、培養和鑒定 利用全骨髓貼壁培養法提取大鼠雙下肢骨髓間充質干細胞，收集第2代對數生長期細胞，流式鑒定表面分子CD29、CD90、CD45；復蘇新購的HSCs，取第3代生長活躍的細胞，倒置相差顯微鏡下觀察活體細胞形態學改變，采用熒光免疫法檢測α-SMA的表達。

1.2.2 細胞共培養體系的建立及實驗分組 6孔板半透膜（直徑0.4μm）上層每孔接種1×105個細胞，下層接種5×104個細胞/孔。實驗分組：（1）H組，HSCs單獨培養（半透膜上層只有培養基）。（2）H-H組，HSCs和HSCs共培養。（3）M-H組，BMSCs與HSCs共培養。（4）M-H-C組，c-met抑制劑2 mmol/L預先封閉HSCs表面肝細胞生長因子（HGF）受體，4 h后BMSCs與HSCs共培養；48 h后倒置相差顯微鏡下動態觀察活體細胞形態學改變。

1.2.3 MTT法檢測HSCs增殖抑制率 各組細胞共培養48 h后，抽取上清液保留備用，0.25%胰酶消化貼壁細胞，用各組共培養上清液分別重懸各組細胞，以3 000個細胞/孔均勻接種在96孔板上，孵育4 h，向各孔加10μL MTT液，4 h后棄上清，各孔加100μL二甲基亞砜（DMSO），在酶標儀上測定各孔在450 nm處的光密度（OD）值；細胞生長抑制率=（H組平均OD值-各處理組平均OD值）/H組平均OD值×100%。

1.2.4 共聚焦顯微鏡檢測HSCs中α-SMA的表達 各組細胞共培養48 h后，棄上清，4%多聚甲醛固定細胞15 min，0.2%Triton-X-100透膜3 min，5%BSA封閉，孵α-SMA抗體，4℃過夜，次日暗室加熒光二抗，37℃孵育1～2 h，PI染核1 min，PBS洗4次，抗熒光淬滅劑封片，即刻采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.5 流式細胞儀檢測HSCs凋亡率 各組細胞共培養48 h后，用不含EDTA的胰酶消化細胞，收集各組HSCs并計數，按照Annexin V-PE/7-ADD細胞凋亡試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 ELISA檢測共培養上清液HGF濃度 各孔中加入不同濃度的標準品或上下兩層共培養上清液，按照肝細胞生長因子ELISA試劑盒說明書嚴格操作，用酶標儀在450 nm波長處測量各孔OD值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在雙對數坐標紙上繪制四參數邏輯函數的標準曲線，根據標準曲線計算各組細胞上清液中HGF濃度。

1.3 統計學方法 應用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，所有計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態特征及鑒定情況 原代BMSCs以集落為中心呈放射狀向周圍生長，培養至5～7 d時，細胞呈現明顯的旋渦狀。BMSCs流式鑒定結果顯示，99.3%的細胞表達CD29，98.9%的細胞表達CD90，0.8%的細胞表達CD45，表明提取的原代細胞為純化的BMSCs。HSCs在倒置顯微鏡下呈星形或多邊形伸展狀態，共聚焦結果顯示活化后的HSCs胞膜及胞漿表達α-SMA，符合實驗要求，見圖1。

2.2 BMSCs抑制肝星狀細胞的增殖 各組細胞共培養48 h后顯示，BMSCs對HSCs的增殖抑制率最大，HSCs對HSCs的增殖抑制率次之，M-H-C組幾乎無抑制，M-H組與H-H組、M-H-C組相比均有統計學意義（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Effects of BMSCs on HSCs after 48-hour co-culture表1 共培養48 h后BMSCs對HSCs的影響 （±s）

Tab.1 Effects of BMSCs on HSCs after 48-hour co-culture表1 共培養48 h后BMSCs對HSCs的影響 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與H組比較，b與H-H組比較，c與M-H組比較，P＜0.05

組別H組H-H組M-H組M-H-C組F增殖抑制率（%，n=3）-13.46±5.75 25.41±0.89b 0.62±0.82bc 40.085＊＊α-SMA熒光強度（n=5）117.50±6.25 108.98±7.22 11.83±1.72ab 124.29±6.75c 401.170＊＊凋亡率（%，n=3）6.30±3.72 6.30±0.70 14.07±3.85ab 6.57±0.71c 5.963＊HGF濃度（ng/L，n=3）14.22±0.78 16.59±3.61 42.88±4.53ab 15.58±0.80c 65.006＊＊

2.3 BMSCs抑制HSCs的活性 與M-H組比較，其余3組HSCs胞膜和胞漿α-SMA表達量均增高，差異有統計學意義（P＜0.005），而其余3組間比較差異無統計學意義，見表1、圖1。

Fig.1 α-SMA expression of hepatic stellate cells in each group（×200）圖1 各組肝星狀細胞α-SMA表達量（×200）

2.4 BMSCs促進肝星狀細胞的凋亡 流式結果顯示，H組、H-H組、M-H-C組HSCs凋亡率較低，且3組差異無統計學意義，M-H組HSCs凋亡率明顯高于H組、H-H組、M-H-C組，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖2、表1。

2.5 共培養上清液中HGF的濃度 ELISA結果顯示，繪制的標準曲線與標準相符（R2=0.99），共培養48 h后，M-H組上清液HGF濃度明顯高于H組、HH組、M-H-C組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

Fig.2 The image of apoptosis in hepatic stellate cells圖2 肝星狀細胞凋亡圖

3 討論

目前肝硬化患者尚缺乏有效的治療方法，干細胞因具有免疫原性低、易體外擴增、多向分化潛能，給肝硬化患者帶來了新的希望。越來越多的研究表明干細胞移植治療可以逆轉肝纖維化和肝硬化，但具體機制尚不明確［4-5］。體內實驗發現，BMSCs經尾靜脈注射入四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化大鼠體內，肝纖維化程度降低，HSCs的數量較對照組明顯減少，凋亡率明顯增高，這為BMSCs治療肝纖維化的機制提供了新的思路［6］。HSCs經體外傳代可被激活，活化HSCs細胞外基質的合成和降解失衡，導致細胞外基質增多，從而形成纖維化。

以往研究發現，間充質干細胞（MSCs）通過定向遷移到肝纖維化組織［7］，分化為肝樣細胞［8］，并通過抗肝細胞凋亡改善肝功能［9-10］，α-SMA是HSCs活化的標志，MSCs可以抑制成纖維細胞的增殖和α-SMA的表達，并促進基質金屬蛋白酶的分泌［11］。Parekkadan等［12］在 BMSCs與HSCs共培養中發現，BMSCs來源的白細胞介素（IL）-10和腫瘤壞死因子（TNF）-α可抑制HSCs的增殖和膠原合成。本研究發現BMSCs與HSCs共培養48 h，BMSCs會明顯抑制活化態HSCs的增殖并促進其凋亡，且作用和上清液中HGF的濃度有關，在HGF濃度最高的M-H組中，HSCs的增殖率最低，而凋亡率最高；當封閉HGF受體（c-met）后，增殖率升高同時凋亡率下降，說明BMSCs可能通過分泌的HGF抑制HSCs的增殖并促進其凋亡。韋柳萍等［13］檢測了BMSCs與HSCs共培養24、48、72 h后HSCs的凋亡率，發現隨著培養時間的延長，HSCs的凋亡率逐漸增加，且在72 h時達到最高。然而，本研究在前期預實驗過程中發現，H組在培養72 h后，HSCs的凋亡率也明顯增高，說明此時HSCs的高凋亡率并不是由BMSCs引起的，可能是培養體系中未更換新的培養基而無法滿足HSCs的生長要求，亦或是HSCs分泌的因子引起的。Wang等［14］將BMSCs與LX2在transwell小室共培養后發現，LX2中α-SMA的表達量明顯降低，當敲低c-met后，BMSCs不能改變活化LX2中α-SMA的表達量。本研究結果同樣也顯示，在BMSCs與HSCs共培養48 h后，BMSCs使活化態的HSCs活性降低，當封閉HGF/c-met信號通路后，效應消失，說明BMSCs可通過分泌的HGF抑制HSCs的活化。

MSCs可以旁分泌多種細胞因子，如HGF、IL-10、胰島素樣生長因子-1、神經生長因子、血管內皮生長因子、腫瘤壞死因子等。HGF是一種多效生長因子，在細胞的分裂、存活、遷移、形態發生等方面發揮著重要的作用。本研究在M-H組上清液中檢測到高濃度的HGF，說明BMSCs可分泌HGF。而HSCs活化后可表達 HGF 受體 c-met［15］，c-met受體屬于酪氨酸激酶家族，HSCs通過分泌TNF-α、IL-6等因子刺激MSCs分泌HGF、IL-10等，HGF與HSCs表面的c-met受體結合后激活c-met位點，通過HGF/c-met信號通路對HSCs產生影響。本實驗發現，在HGF濃度最高的M-H組中，HSCs的凋亡率最高，HSCs的增殖和活化最低，當封閉HGF/c-met信號通路后，效應消失，表明BMSCs對HSCs的影響可能是BMSCs分泌HGF通過HGF/c-met信號通路起作用的。然而，HGF/c-met下游有Akt/PKB、PI3K、JNK、ERK/MAPK、PIP3等通路，具體是哪條通路起主要作用還有待進一步研究。

此外，MSCs還可通過免疫調節和炎癥抑制的作用，抑制T、B淋巴細胞的增殖，促進抑制性細胞因子分泌，減少炎癥性細胞因子產生，從而減輕肝臟炎癥反應和肝細胞的破壞［16-17］。隨著外泌體的提出，越來越多的學者認為MSCs改善肝纖維化與外泌體有關［18-19］。Schorey等［20］認為外泌體為 MSCs與 HSCs間傳遞通訊的載體。Li等［21］認為來源于人臍帶MSCs的外泌體通過抑制肝細胞的上皮-間充質轉化、顯著恢復血清天冬氨酸轉氨酶活性，并通過降低Ⅰ/Ⅲ型膠原、轉化生長因子-β1（TGF-β1）以及Smad2的磷酸化，使TGF-β1/Smad信號通路失活，從而改善肝纖維化。

綜上所述，BMSCs可使HSCs的增殖、活化受到抑制，凋亡增加，其機制可能是BMSCs旁分泌HGF通過HGF/c-met信號通路起作用的，這也可能是BMSCs移植治療肝纖維化的機制之一。