miR-126對男性喉癌患者進展影響的生物信息學分析

魏梅，王曉雨，杜建群，林鵬

喉癌是一類常見惡性腫瘤［1］，探究喉癌發(fā)生發(fā)展的機制，積極診治對保留喉發(fā)聲及其他功能具有重要作用。微小RNA（microRNA，miRNA）是真核細胞中一類非編碼小RNA，可通過調(diào)控多個靶基因影響胚胎發(fā)育［2］及腫瘤［3］等疾病進展。目前，雖有miR-126影響胃癌［4］、肺癌［5］等腫瘤進程的報道，但鮮見其對喉癌影響的綜合研究。本文通過對腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫的分析，系統(tǒng)了解miR-126通過哪些靶基因影響男性喉癌患者的進展，并對靶基因基因本體論和參與的信號通路進行分析，旨在為喉癌的治療提供新的靶點和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料 喉癌患者相關TCGA數(shù)據(jù)（更新時間2017年11月27日）由UCSC Xena（https://xenabrowser.net/datapages/）下載，根據(jù)性別、年齡、總生存率（overall survival，OS）、腫瘤分級、臨床分期以及miRNA和mRNA表達量數(shù)據(jù)的完整性篩選得到97例男性喉癌患者數(shù)據(jù)。根據(jù)TCGA編號末尾數(shù)發(fā)現(xiàn)其中10例患者不僅具有腫瘤組織表達量，同時具有癌旁miR-126表達數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)整理為10對患者miR-126癌與癌旁配對表達數(shù)據(jù)。

1.2 分組 根據(jù)miR-126表達水平的平均值將患者分為低表達和高表達組；根據(jù)年齡平均值分為低齡組和高齡組；腫瘤分級G1和G2為低分級組，G3和G4為高分級組；臨床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期為低級別組，Ⅳ期為高級別組。

1.3 miR-126有效靶基因的分析 通過檢索miRWalk 2.0數(shù)據(jù)庫（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）得到已驗證的與miR-126相互作用的靶基因，并在TCGA數(shù)據(jù)庫中找出相應靶基因mRNA表達量值，根據(jù)各組基因表達量的平均值將其分為相應基因的低表達量組和高表達量組，若Kaplan-Meier（K-M）法分析發(fā)現(xiàn)其表達量與喉癌患者總生存率有關，則認為該基因是miR-126影響男性喉癌生存的有效靶基因。

1.4 富集分析方法 將有效靶基因作為gene list提交到DAVID預測分析網(wǎng)站（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），其余參數(shù)均選擇默認，轉(zhuǎn)換成相應的基因號提交分析系統(tǒng)，選擇物種為“Homo sapiens”，對有效靶基因進行基因本體（GO）注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路進行富集分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 用IBM SPSS Statistics 19.0、GraphPad Prism 7、Excel 2013對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示；采用K-M法分析相應基因表達量與OS間的關系；男性喉癌患者預后影響因素分析采用Cox比例風險模型；配對的癌與癌旁miR-126表達量差異分析采用配對樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌患者數(shù)據(jù)基本信息 97例男性喉癌患者年齡38～83歲，平均（62.2±9.0）歲，以年齡平均數(shù)62.2歲為界限分為低年齡組（≤62.2歲，51例）和高年齡組（＞62.2歲，51例）；miR-126平均表達量為10.964±0.906，以平均值為界限分為低表達（49例）和高表達組（48例）；腫瘤低分級組有62例，高分級組有31例，4例分級不確定；臨床分期低級別組33例，高級別組60例，4例未確定分級。

2.2 miR-126是男性喉癌患者預后的獨立影響因素 K-M法分析發(fā)現(xiàn)，miR-126對男性喉癌患者總生存率影響明顯（P=0.001），高表達組的預后明顯優(yōu)于低表達組，miR-126高表達有利于延長男性喉癌患者的生存時間（圖1）。聯(lián)合考慮患者的年齡、腫瘤分級、臨床分級以及miR-126表達量，進行多因素Cox比例風險模型分析。結(jié)果顯示，miR-126是男性喉癌患者預后的獨立影響因素，見表1。

Fig.1 KM plot of miR-126 expression and overall survival rate in patients with laryngeal cancer圖1 喉癌患者miR-126表達量與總生存率間關系函數(shù)圖

Tab.1 Multivariate Cox proportional hazard analysis of patients with laryngeal cancer表1 喉癌患者多因素Cox回歸分析

具有癌與癌旁miR-126表達量的10例患者中，miR-126在癌組織的平均表達量為10.170±0.811，而在癌旁正常組織的平均表達量為11.059±0.612，miR-126在腫瘤中的表達量低于癌旁正常組織（t=3.098，P=0.013），這進一步說明miR-126能夠抑制腫瘤的發(fā)展。

2.3 miR-126靶基因的預測 通過miRWalk2.0數(shù)據(jù)庫檢索miR-126的靶基因，發(fā)現(xiàn)該miRNA有L2HGDH、GRIN2B、NFKBIA、KRAS、SIRT1、CRK等58個靶基因，這些靶基因已在一種或多種實驗方法中得到驗證，這些實驗方法包括紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測序、報告基因檢測、免疫組化、逆轉(zhuǎn)錄PCR、蛋白印跡檢測等。見表2。

2.4 miR-126靶基因在喉癌患者中的表達差異分析 通過K-M法分析發(fā)現(xiàn)，58個靶基因中7個基因的不同表達水平對喉癌患者的生存具有一定的影響（P＜ 0.05），這7個有效靶基因為DNMT1、GRIN2B、L2HGDH、PIK3R2、PTPN7、SIRT1、TWF1。TWF1基因低表達患者生存期較長，而其他基因高表達者生存期較長，見圖2。

Tab.2 The information of miR-126 target genes表2 miR-126靶基因信息

2.5 miR-126有效靶基因GO注釋分析 GO注釋分析結(jié)果顯示，靶基因DNMT1、SIRT1參與了異染色質(zhì)的組成，異染色質(zhì)的出現(xiàn)往往會降低基因的轉(zhuǎn)錄活性，miR-126可以通過參與基因結(jié)構(gòu)的調(diào)控影響細胞活動。分子功能方面，靶基因?qū)Υ呋磻娃D(zhuǎn)移酶的激活具有影響。50%以上的有效靶基因參與的生物學過程達到了9個，其中所有有效靶基因均參與的過程為細胞大分子的代謝過程，細胞代謝產(chǎn)生的能量及小分子物質(zhì)對細胞的正常生長及病變均有重要的作用。另外一大部分有效靶基因還參與大分子修飾、磷酸化調(diào)控等過程。見表3。因此miR-126既能通過影響喉癌細胞中染色體的轉(zhuǎn)錄活性，也可通過調(diào)控癌細胞中能量的代謝過程來影響喉癌患者的病程。

2.6 miR-126有效靶基因KEGG通路分析 有效靶基因KEGG通路富集結(jié)果顯示，GRIN2B和SIRT1參與了Amphetamine addiction通路，對其藥物的代謝存在影響。PIK3R2、SIRT1參與了AMPK信號通路和FoxO信號通路。AMPK通路作為一個能量代謝調(diào)節(jié)的關鍵通路，影響整個細胞的生命活動，能量代謝的失控可能會導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，F(xiàn)oxO信號通路的改變會導致細胞凋亡、細胞周期調(diào)控、葡萄糖代謝等過程失控。

3 討論

Fig.2 KM plot of effective target gene expression and overall survival rate in patients with laryngeal cancer圖2 喉癌患者有效靶基因不同表達量患者的總生存曲線圖

miRNA作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后修飾方式，對基因的表達具有重要的作用，因此探究miRNA調(diào)控腫瘤的研究越來越多，miRNA通常會調(diào)控多種靶基因的表達，靶基因綜合作用的結(jié)果導致其對腫瘤的影響，然而大量研究往往只針對miRNA的一個或一類靶基因，因此綜合分析所有靶基因?qū)ρ芯縨iRNA的作用具有重要意義。

3.1 miR-126高表達利于延長男性喉癌患者生存時間 本研究顯示，miR-126高表達男性喉癌患者總生存率明顯提高，且在癌旁的正常組織中的表達量明顯高于癌組織，與在前列腺癌［6］和肺癌［7］中的研究結(jié)果一致。本文首次通過TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對miR-126對男性喉癌的影響展開研究，為進一步研究提供了數(shù)據(jù)支持。

3.2 miR-126通過7個靶基因影響男性喉癌的進展 雖然已有文獻對miR-126的所有靶基因及其在人體正常器官中的功能進行過分析［8］，但它在喉癌中的作用尚鮮見研究。本文通過對靶基因?qū)δ行院戆┗颊呱嬗绊懙姆治觯l(fā)現(xiàn)58個靶基因中有7個基因?qū)δ行院戆┗颊叩纳嬗兄匾挠绊憽?個基因中DNMT1［9］和SIRT1［10］已在喉癌研究中報道，其他5個基因是我們通過數(shù)據(jù)分析后新發(fā)現(xiàn)的影響男性喉癌患者生存的因素，這為在分子機制方面研究喉癌進展提供了新的思路。

3.3 有效靶基因功能分析 通過對有效靶基因的分析可以深入了解靶基因在細胞中的作用，為分析miR-126對腫瘤患者的影響提供更多的研究方向。GO富集從參與的生物學過程、細胞組分及分子功能方面分析發(fā)現(xiàn)有效靶基因DNMT1、SIRT1可以通過參與異染色質(zhì)的出現(xiàn)，進而對相應基因的表達進行調(diào)控來影響腫瘤發(fā)展［11］。分子功能方面，大部分有效靶基因?qū)Υ呋磻娃D(zhuǎn)移酶的激活具有影響。細胞代謝、大分子修飾等9個生物學過程參與的有效靶基因達到一半以上，其中所有有效靶基因均參與了細胞大分子的代謝過程，細胞能量代謝的異常以及中間產(chǎn)物非正常的積累往往會導致細胞分化增殖的失調(diào)，進而會引發(fā)腫瘤的發(fā)生［12-13］。另外，大分子修飾、磷酸化等過程也會影響腫瘤進程。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，PIK3R2、SIRT1參與的AMPK信號通路和FoxO信號通路正是能量代謝與細胞凋亡相關的信號通路［14］，AMPK是FoxO信號通路上游的重要分子［15］，兩者共同作用可以調(diào)控細胞周期、凋亡等過程，進而會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

Tab.3 GO enrichment analysis of miR-126 effective target gene表3 miR-126有效靶基因的GO富集分析

Tab.4 Signal pathway enrichment analysis of miR-126 target gene表4 MiR-126靶基因信號通路富集分析

綜上，本研究分析發(fā)現(xiàn)，miR-126通過DNMT1、GRIN2B、L2HGDH、PIK3R2、PTPN7、SIRT1、TWF1這7個靶基因調(diào)節(jié)代謝和細胞凋亡等過程，進而延長男性喉癌患者的總生存率，通過本文的分析，可以使我們通過能量代謝途徑分析研究miR-126與男性喉癌進展的關系，為進一步研究提供了理論支持。