CHOP療法對T細胞淋巴瘤Hut 78和HH細胞環狀RNA circ_001569及其下游蛋白表達的影響

康慶偉，閻姝

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）可以根據其起源分為T細胞淋巴瘤和B細胞淋巴瘤。對于多數T細胞淋巴瘤患者，CHOP療法［環磷酰胺（Cyclophosphamide）+羥基柔紅霉素（Hydroxydaunorubicin）+長春新堿（Oncovin）+潑尼松（Prednisone）］是常用的治療手段之一［1-2］。環狀RNA（circRNAs）是廣泛存在于真核細胞中的一種非編碼RNA。研究表明，circRNAs在腫瘤的病理過程中起到了一定的調節作用，并且有可能成為腫瘤早期診斷的重要標志物［3］。circRNA_001569 是circRNAs的一種，其在結直腸癌中表達水平增高，并且可以通過反向調節微小RNA（miR）-145，進而促進E2F轉錄因子5（E2F transcription factor 5，E2F5）、BAG家族分子伴侶蛋白調節因子4（BAG family molecular chaperone regulator 4,BAG4）和類甲酸蛋白2（Formin-like protein 2，FMNL2）基因的表達［4］。CHOP療法應用過程中常引起白細胞降低、貧血、出血風險增高、脫發等不良反應［5］，深入研究其作用機制，有助于進一步了解淋巴瘤的發病機制和病理過程。本研究采用CHOP療法中的4種治療藥物處理T細胞淋巴瘤Hut78和HH細胞系，檢測其對環狀RNA circRNA_001569及其下游miRNA和相關基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Hut78細胞（TIB-161?）、HH細胞（CRL-2105?）購自美國ATCC?，胎牛血清、1640培養基購自美國Hyclone公司；RNAiso Plus（貨號：9108）、MicroRNA first-strand synthesis and miRNA quantitation kits（貨號：638315）購自 TaKaRa公司；ProtoScript?Ⅱ Reverse Transcriptase（貨號：M0368S）購自英國New England Biolabs；PCR試劑（貨號：MasterMix-LR）購自加拿大ABM公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞裂解液（貨號：P0013）購自杭州碧云天生物技術有限公司；Immun-Blot?PVDF膜（貨號：1620177）購自美國Bio-Rad；細胞增殖檢測試劑盒（貨號：G3582）購自美國Promega；兔源BAG4多克隆抗體（貨號：ab134051）、兔源β-actin多克隆抗體（貨號：ab8227）、鼠抗兔二抗（貨號：ab99696）購自美國Abcam；環磷酰胺（貨號：C126044-500 mg）、羥基柔紅霉素（貨號：D107159-100 mg）、長春新堿（貨號：V107236-100 mg）、潑尼松（貨號：P116562-1 g）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 細胞培養 Hut78細胞和HH細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱中采用含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的1640培養基進行培養，每2 d換液1次。

1.3 細胞分組及處理 Hut78細胞和HH細胞均設對照組、環磷酰胺組（1μmol/L）、羥基柔紅霉素組（0.2μmol/L）、長春新堿組（1μmol/L）、潑尼松組（1μmol/L），各組加藥處理24 h后，收集細胞進行檢測。

1.4 細胞增殖實驗 采用CellTiter 96?AQueousOne Solution Cell Proliferation Assay（MTS）試劑盒檢測Hut78細胞和HH細胞的增殖情況，具體操作按照試劑盒說明書進行，每組設6個重復孔。

1.5 RNA提取及逆轉錄 按照RNAiso Plus試劑說明書提取總RNA。RNA樣品采用Nanodrop 2000檢測A260/A280，確定RNA純度及濃度。采用NEB ProtoScript?ⅡReverse Transcriptase進行逆轉錄，具體操作按照說明書進行。miR-145莖環法逆轉錄引物序列為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACCAT-3′。

1.6 實時定量PCR 按照PCR試劑盒說明書，在ABI 7500 fast儀器上進行實時定量PCR操作，PCR反應體系為2×SYBR Green Mix 10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA 2μL，ddH2O 7.2μL。反應條件為：50℃ 2 min；95℃ 5 min；95℃15 s，60 ℃ 40 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算基因mRNA表達水平，每個樣品設3個復孔。實時定量PCR采用的引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence of qPCR表1 實時定量PCR引物序列

1.7 Western blot檢測miR-145下游分子BAG4的表達 將羥基柔紅霉素組和長春新堿組細胞用PBS液清洗3次，1 000 r/min離心15 min收集細胞，IP細胞裂解液裂解細胞后，加入上樣緩沖液煮沸10 min，12 000 r/min離心20 min后取上清，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉過夜，次日TBST洗膜3次，BAG4（1∶2 000）、β-actin（1∶2 000）一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。分別用鼠抗兔二抗4℃孵育過夜后，TBST洗膜3次，每次10 min，最后ECL化學發光檢測，采用UVITEC化學發光成像分析系統Alliance MINI HD6進行拍照記錄并計算各組蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS 19.0對數據進行統計分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖實驗結果 環磷酰胺、羥基柔紅霉素、長春新堿和潑尼松均可顯著抑制Hut78細胞和HH細胞的增殖（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 The results of cell proliferation in different groups圖1 各組細胞增殖實驗結果

2.2 各組細胞circRNA_001569和miR-145表達變化 與對照組相比，羥基柔紅霉素和長春新堿可抑制Hut78細胞和HH細胞中circRNA_001569的表達，促進miR-145的表達（P＜0.05）；而環磷酰胺組和潑尼松組與對照組相比，circRNA_001569和miR-145表達差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、3。

Fig.2 Changes of circRNA_001569 expression levels in different groups圖2 各組circRNA_001569表達變化

Fig.3 Changes of miR-145 expression levels in different groups圖3 各組miR-145表達變化

2.3 羥基柔紅霉素和長春新堿可以降低Hut78細胞和HH細胞中BAG4表達 為了進一步探索羥基柔紅霉素和長春新堿的抗腫瘤機制，本研究從基因和蛋白水平均證實羥基柔紅霉素、長春新堿均可降低Hut78和HH細胞系中BAG4的表達。見圖4、5。

Fig.4 Hydroxydaunorubicin and oncovin inhibited the mRNA expression level of BAG4 in Hut78 and HH cells圖4 羥基柔紅霉素、長春新堿均可抑制Hut78細胞和HH細胞中BAG4 mRNA的表達

3 討論

Fig.5 Hydroxydaunorubicin and oncovin inhibited the protein expression level of BAG4 in Hut78 and HH cells圖5 羥基柔紅霉素、長春新堿可以顯著抑制Hut78細胞和HH細胞中BAG4的蛋白表達水平

在非霍奇金淋巴瘤的治療中，CHOP作為一種常用的化療方法得到了廣泛的使用，臨床上取得了一定的療效，但是其不良反應較多。為了增強其療效，減輕不良反應，改善患者的生存質量，臨床中常采用CHOP聯合其他藥物來治療T細胞淋巴瘤，如利妥昔單抗等。circRNAs是一個閉合、連續的環狀結構，不具有線性RNA擁有的3′和5′端的尾部結構，相比線性RNA更為穩定［6］，可以起到對miRNA的“海綿”吸附作用，進而調節基因表達［7］。并且其有可能成為腫瘤的早期診斷的標志物，具有重要的臨床意義［8-10］。既往多項研究發現，環狀RNA CDR1as與肝癌微血管侵襲有關，是肝癌和膽管癌發生的生物標志物［11-13］。Chen等［14］發現在胃癌組織中Circ-PVT1表達異常增高，可能與其對miR-125產生吸附作用，進而促進胃癌細胞增殖有關。在肝癌細胞中，circ_0005075和circ_0001649在腫瘤組織和癌旁組織中存在差異性表達，具有成為生物標志物的潛力［12，15］。在結直腸癌中，circRNA_001569表達上調，通過其對miRNA的“海綿”吸附作用，特異性降低miR-145的表達，并且解除miR-145對E2F5、BAG4和FMNL2的抑制［4］。但在淋巴瘤中鮮見有關環狀RNA circRNA_001569和miR-145的相關研究報道。目前對于環狀RNA的研究大多是有關環狀RNA對腫瘤增殖及相關信號通路等方面的影響，對于藥物藥理機制的研究較少。而本研究發現，羥基柔紅霉素、長春新堿可以顯著抑制Hut78細胞和HH細胞中circRNA_001569的表達，說明在抗腫瘤藥物的作用下，某些環狀RNA的表達發生了改變，其抗腫瘤作用有可能是通過環狀RNA的調節而產生。

BAG4也被稱為死亡結構域沉默子（silencer of death domains，SODD），是BAG1相關蛋白家族的一員，在細胞核和細胞質中均有表達。Yi等［16］證實BAG4可增加GC細胞的增殖和侵襲，可能是胃癌的治療靶點。而缺失BAG4將會導致對于鉑類化療藥物的抵抗［17］。在急性淋巴細胞白血病中，BAG4表達水平升高，并且參與了腫瘤細胞的凋亡以及化療藥物耐藥性抵抗作用［18］。本研究表明，羥基柔紅霉素、長春新堿不但可以對Hut78細胞和HH細胞中circRNA_001569的表達產生一定的調控作用，同時可以顯著抑制其下游BAG4的蛋白表達水平。提示環狀RNA circRNA_001569可能在T細胞非霍奇淋巴瘤中起到了一定的調控作用，有必要進一步深入研究