艾灸對缺氧缺血性腦病新生小鼠腦組織炎癥細胞浸潤和CD11b表達的影響

肖愛嬌，肖移生，歐陽昕，賀琳，陳明人△

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是新生兒時期較為常見的疾病之一，是指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧，腦血流減少或暫停而導致胎兒或新生兒腦損傷［1］。該病具有較高的致死率和致殘率［2-3］。研究表明，炎癥反應可能在新生兒HIE的發病過程中起重要作用［4-5］。Smith等［6］研究發現，腦缺氧缺血時，腦組織出現大量炎癥細胞浸潤，且浸潤的炎癥細胞主要是CD11b陽性細胞（小膠質細胞的重要標志物）。本課題組前期研究顯示，腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中CD11b表達增加［7］。

艾灸作為一種傳統的中醫療法，臨床上廣泛應用于卒中等疾病的治療，并取得了較好的效果。動物實驗研究顯示，艾灸具有減輕腦缺血再灌注損傷、減少CD11b陽性細胞的作用［7］，提示小膠質細胞可能參與了缺血性腦損傷的病理過程；艾灸可能通過減少小膠質細胞浸潤來減輕腦缺血再灌注損傷。有關艾灸能否通過減少炎癥細胞（如小膠質細胞）浸潤，緩解炎癥反應，從而減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷尚未明確。為此，本文在前期研究的基礎上，觀察艾灸對模型小鼠腦組織炎癥細胞浸潤及腦組織CD11b陽性細胞的影響，探討艾灸減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 清潔級ICR小鼠64只，出生7 d，雌雄不拘，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［SCXK（湘）2013-0004］。一抗：ab75476兔抗小鼠CD11b購自艾博抗（上海）貿易有限公司；二抗：A11011山羊抗兔、P36931熒光封片劑［含DAPI（4′-6′diamino-2-phenylindole，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）購自美國Invitrogen公司。DL-SSJ頭戴式手術顯微鏡購自中國DL公司，Leica 2000熒光顯微鏡及圖像分析軟件購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 新生小鼠隨機分為3組。HI模型組24只：閉合左側頸總動脈，并給予缺氧處理。艾灸組20只：同模型組，并于缺氧處理后進行艾灸治療，35 min/次，1次/d。假手術組20只：只做頸部手術，不閉合頸總動脈，不缺氧。

1.2.2 HIE模型制備 參照Rice等［8-9］方法制備HIE新生小鼠模型：（1）動物在異氟烷吸入麻醉狀態下行頸部正中切口，分離、閉合左側頸總動脈，縫合切口。（2）動物在室溫中蘇醒和母乳喂養2 h后，進行缺氧處理，即將動物置于37℃的密閉艙內，通入氮氣（N2），調節氧氣（O2）濃度為8%，100 min后取出。

1.2.3 艾灸取穴 參考文獻［10］中針灸腧穴定位方法取“大椎”穴作為治療穴位。大椎穴位于督脈上，第7頸椎與第1胸椎棘突間，背部正中。艾灸方法：在腦缺血缺氧后次日，艾灸“大椎”穴進行治療，每日1次，35 min/次。

1.2.4 腦組織梗死檢查 于造模后3 d，假手術組、模型組及艾灸組分別取6、10及6只鼠進行腦組織TTC染色。給予小鼠異氟醚吸入麻醉后迅速取腦，以1.5 mm左右間隔自額向枕切成4個冠狀切片，加入1%TTC染液，置于37℃溫箱中染色20 min，用掃描儀進行掃描，Image J軟件（National institute of Health，USA）測量每張腦片的梗死面積，并計算梗死面積百分比。梗死面積計算參見文獻［11-13］：梗死面積（%）=［健側半球面積-（患側半球面積-梗死面積）］/健側半球面積×100%。

1.2.5 腦組織形態學觀察 于造模后3 d，各組分別取7只鼠進行腦大體形態學觀察。給予動物異氟醚吸入麻醉后迅速取腦，數碼相機拍照。然后切片，厚5μm，HE染色后封片，顯微鏡（×200）觀察。

1.2.6 腦組織CD11b陽性細胞數檢測 于造模后3 d，各組分別另取7只鼠進行熒光免疫組織化學法檢測，參見文獻［7］進行操作。腦組織CD11b陽性的部位呈紅色，細胞核呈藍色，用Image J軟件進行圖像分析，計數每個視野下（×200）的CD11b陽性細胞數。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism 5進行統計學分析。符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，不符合者進行lg對數轉換后進行計算，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重性比較采用Tukey法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦組織梗死觀察 假手術組腦組織經TTC染色后全部染成紅色，未見梗死灶；模型組右側半球呈紅色，左側半球出現白色梗死灶，梗死比例為（36.46±19.72）%；艾灸組右側半球呈紅色；左側半球出現小面積白色梗死灶，梗死比例為（19.92±10.10）%，較模型組減少（F=11.900，P＜0.05），見圖1。

Fig.1 TTC staining of brain coronal section of mice圖1 腦組織TTC染色結果

2.2 腦組織形態學觀察 （1）大體觀察。假手術組腦組織紅潤，腦溝及腦回清晰，左右半球基本對稱；模型組左側腦組織萎縮、塌陷；艾灸組左側腦可見小面積白色梗死灶，腦溝變淺，見圖2。（2）鏡下觀察。假手術組腦組織細胞排列整齊、致密；模型組患側腦組織細胞排列疏松，可見大量細胞脫落，以及大量炎癥細胞浸潤；艾灸組患側腦組織排列較整齊、致密，有少量炎癥細胞浸潤，見圖3。

Fig.2 Pictures showing gross morphology of mouse brain圖2 小鼠腦大體形態學觀察

2.3 各組腦組織CD11b陽性細胞數比較 假手術組、模型組及艾灸組的患側腦組織CD11b陽性細胞數分別為7.74±4.11、42.00±13.01及14.57±3.05（單位：個；F=35.350，P＜0.05），其中模型組多于假手術組，而艾灸組少于模型組（P＜0.05）；假手術組與艾灸組差異無統計學意義，見圖4。

Fig.3 HE staining of brain section of mice(×200)圖3 小鼠腦組織HE染色情況（×200）

Fig.4 The expression of CD11b in mouse brain detected by immunofluorescence staining（×200）圖4 組織免疫熒光染色檢測小鼠腦組織CD11b表達結果（×200）

3 討論

艾灸作為針灸療法的重要組成部分，是借助艾草燃燒時發出的藥力和紅外線溫熱刺激，來熏灼特定的穴位，刺激組織以調和氣血、疏通經絡，從整體上調節臟腑功能，以達到治病防病、養生保健的目的。該療法操作簡便，療效顯著，無任何不良反應，日益受到患者的青睞。然而，有關艾灸治療急性新生兒缺氧缺血性腦病的報道很少，其治療急性新生兒缺氧缺血性腦病的作用機制研究也并不多見。為此，本實驗首先制備缺氧缺血性腦損傷新生小鼠模型，觀察艾灸治療新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的療效。經TTC染色后觀察發現，假手術組小鼠腦組織被染成紅色，未見梗死灶；模型組和艾灸組小鼠左側半球都可見白色梗死灶，經計算分析，模型組小鼠腦梗死面積較大，而艾灸組小鼠腦組織梗死面積明顯縮小，差異有統計學意義。此外，從腦的大體觀察來看，假手術組小鼠的腦組織紅潤，腦溝及腦回清晰，左右兩半球基本對稱；模型組小鼠左側腦半球明顯萎縮、塌陷，腦溝和腦回消失；而艾灸組小鼠左側腦梗死灶明顯縮小。由此可見，艾灸“大椎”穴可有效地減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷。

多項研究顯示，在新生兒缺氧缺血性腦損傷的發病機制中，有許多相互關聯的機制在起作用，涉及的主要病理生理過程有興奮性毒性、細胞凋亡和炎癥等。其中，炎癥反應可能在新生兒HIE的病理過程中起重要作用［4-5］。炎癥細胞浸潤是炎癥反應的重要病理特征，這些炎癥細胞在發揮吞噬作用、免疫調節作用的同時，也可向細胞外釋放大量活性氧自由基、炎癥細胞因子、基質金屬蛋白酶（MMPs）、白細胞介素等炎癥介質［14］，進一步介導內皮細胞和組織損傷，加重原始炎癥級聯反應，導致腦損傷加劇。本研究HE染色結果顯示，模型組患側腦組織大量細胞脫落，細胞排列疏松，且大量炎癥細胞浸潤；而艾灸組患側腦組織排列較整齊、致密，僅有少量炎癥細胞浸潤，表明新生小鼠缺氧缺血后確實發生了炎癥反應，而艾灸具有減少炎癥細胞浸潤、減輕炎癥反應的作用。

小膠質細胞是中樞神經系統的重要免疫細胞，屬于巨噬細胞的一種。活化的巨噬細胞在病原體等刺激下，一方面可發揮抗感染和免疫調節作用，另一方面也可產生大量促炎癥細胞因子和其他炎癥介質，介導炎癥反應。研究顯示，缺氧缺血性腦病早期可見小膠質細胞激活［15-17］。CD11b是小膠質細胞的重要標志物，Smith等［6］研究也顯示腦缺氧缺血時主要為CD11b陽性細胞浸潤。本研究顯示新生小鼠腦缺氧缺血后3 d，模型組患側腦組織CD11b表達明顯增加，與上述研究結果［6-7］基本一致，而經艾灸治療后，艾灸組患側腦組織CD11b表達減少，提示小膠質細胞參與了急性新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的病理過程，而艾灸可能通過減少小膠質細胞浸潤，減輕炎癥反應。

綜上所述，艾灸“大椎”穴可能通過激發和調動機體自身的抗病能力，減少小膠質細胞浸潤，減輕炎癥反應，從而達到減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷。這也為臨床上運用艾灸治療急性新生兒缺氧缺血性腦病提供了一條新途徑。