MMP-7在膽道閉鎖肝纖維化患者中的表達及臨床意義

余晨，熊希倩，詹江華，胡曉麗，高偉

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是嚴重威脅嬰幼兒生命的膽道梗阻性疾病。目前認為該病主要由炎癥引起，可導致繼發性的肝內外膽道梗阻、纖維化，繼而形成肝衰，但其確切的病理生理學機制尚未完全明確［1］。膽道閉鎖Kasai手術旨在解除膽道梗阻、重建肝外膽道、開放膽汁引流，但術后難以避免的進展性肝纖維化及肝硬化是制約自體肝生存時間的關鍵因素，仍困擾著大多數研究者［2］。

肝臟纖維化的主要特征為細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成大于降解，致使其沉積過多［3］。通過對組織沉積物的研究發現，基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）家族在ECM的降解過程中占據主要地位，是影響肝纖維化的重要因素［4］。此前已有學者關注MMPs與BA肝纖維化之間的聯系，但大多數對于MMPs的研究主要集中于MMP-2、MMP-3、MMP-9等物質，且多數都強調其在血清中的表達，而對于MMP-7的了解卻知之甚少［5-7］。最新的一項研究證實，MMP-7的表達對于診斷BA及預測Kasai術后肝纖維化程度具有高度的特異性［8］?；谏鲜鲈?，本文擬從肝臟移植時獲取的BA患兒病肝組織出發，并對比Kasai術時的肝活檢組織，應用免疫組化手段檢測MMP-7蛋白在Kasai術時及Kasai術后不同時間段患兒肝組織中的表達情況，同時研究其與肝纖維化程度、膽管反應之間的關系，探索BA患兒肝臟進行性纖維化的原因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取天津市兒童醫院2017年6月—2018年4月收集到膽道閉鎖患兒行Kasai手術時的肝活檢組織共計15例（Kasai組，即G1組），其中男7例，女8例；同時收集2015年1月—2016年1月在天津市第一中心醫院因Kasai術后肝功能衰竭而行肝移植病肝組織共計41例（移植組），其中男17例，女24例，患兒均為出生后3個月內行Kasai手術，平均手術日齡為（59.18±14.52）d，后因肝臟功能衰竭而行肝移植手術。肝移植標準［9］：（1）終末期肝病診斷明確，伴有肝硬化的并發癥（腹水、腦病、消化道出血等）。（2）生長發育障礙。（3）反復膽管炎發作，嚴重影響患兒生活質量。將移植組按患兒行Kasai手術與肝移植手術的間隔時間分為2組：G2組28例，間隔時間＜2年；G3組13例，間隔時間≥2年。本研究經過醫院倫理委員會審查通過。

1.2 研究方法

1.2.1 組織處理 肝組織標本均取自術中肝右葉前緣組織，10%福爾馬林固定、石蠟包埋后，將蠟塊標本連續4μm切片，用于HE染色及免疫組化染色（CK-19、MMP-7抗體及染色工作液均購自北京中杉金橋生物科技有限公司）。

1.2.2 HE染色 病理切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水洗后，蘇木素浸5 min，酸化伊紅乙醇液浸染2 min，再經梯度乙醇脫水，透明劑浸泡至透明，中性樹膠封片等操作，在光學顯微鏡下觀察肝組織纖維化程度。

1.2.3 免疫組化染色 病理切片經脫蠟至水，放置于枸櫞酸鹽緩沖液中進行抗原修復15 min，冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗5 min×3次，于3%H2O2中37℃孵育10 min，再用PBS沖洗5 min×3次，分別滴加一抗（MMP-7、CK-19），放置于4℃冰箱中過夜；次日取出后置于室溫，PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗，于37℃下孵育30 min，再經PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色5～10 min，充分水洗，蘇木素液染核，脫水、透明、中性樹膠封片，于鏡下觀察陽性細胞種類及表達情況。

免疫組化陽性標準。（1）定性分析：根據染色強度分為無棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽性）、棕黃色（陽性）、棕褐色（強陽性）。（2）半定量分析：每張切片取5個不同視野100倍顯微鏡下圖片，經IPP（Image-Pro Plus 5.0）圖像分析系統測定CK-19、MMP-7蛋白的平均光密度值（AOD=肝組織陽性細胞光密度總和/陽性面積），代表其相對表達量。

1.3 肝纖維化分級標準 根據Ohkuma'S分級標準［10］將肝臟組織纖維化程度分為Ⅰ～Ⅳ級：Ⅰ級，肝門管區輕度纖維化；Ⅱ級，臨近門管區輕度橋連接纖維化；Ⅲ級，伸向臨近門管區重度橋連接纖維化；Ⅳ級，肝硬化，假小葉形成。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0進行統計學分析，符合正態分布的計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni法；非正態性分布的計量資料采用M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，多重比較用Bonferroni法。相關性分析采用Pearson或Spearman秩相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果 MMP-7蛋白主要表達于膽管上皮細胞、增生的膽管及匯管區周圍肝細胞。G1組肝細胞呈陽性表達，膽管細胞表達強度較弱（圖1A）。在移植組，膽管細胞及肝細胞表達強度增加，且膽管細胞比肝細胞表達更為強烈（圖1C、E）。CK-19在膽管細胞中呈陽性表達，G2組表達強度高于其他2組（圖1B、D、F）。

Fig.1 The immunohistochemical staining result of MMP-7 and CK-19 in the three groups圖1 3組MMP-7和CK-19免疫組化染色結果

2.2 半定量分析結果 3組患兒肝組織內MMP-7和CK-19蛋白表達水平差異具有統計學意義，兩兩比較發現G2組MMP-7和CK-19蛋白表達量明顯高于其余2組（P＜0.05），G1組與G3組上述蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

Tab.1 Comparison of MMP-7 and CK-19 protein expression levels in liver between three groups表1 3組患兒肝組織內MMP-7、CK-19蛋白表達水平比較（AOD，±s）

Tab.1 Comparison of MMP-7 and CK-19 protein expression levels in liver between three groups表1 3組患兒肝組織內MMP-7、CK-19蛋白表達水平比較（AOD，±s）

＊＊P＜0.01；a與G1組比較，b與G2組比較，P＜0.05

組別G1組G2組G3組F n 15 28 13 MMP-7 0.068±0.017 0.093±0.017a 0.084±0.016b 10.541＊＊CK-19 0.119±0.036 0.157±0.040a 0.110±0.044b 7.296＊＊

2.3 相關性分析 G1～G3組的纖維化程度分別為：2（2，3）vs.4（3，4）vs.4（2，4），組間差異有統計學意義（H=17.785，P＜0.01）。兩兩比較發現，G2組纖維化程度明顯高于其余2組（P＜0.017）。將MMP-7的表達量與肝纖維化程度進行Spearman秩相關分析發現，兩者呈弱正相關（rs=0.369，P=0.018），隨著肝纖維化程度加重，MMP-7的表達水平升高，但MMP-7與膽管反應程度（CK-19）無明顯相關性（rs=0.031，P=0.856）。

3 討論

不同于普通肝臟疾病較為緩慢的纖維化進程，膽道閉鎖肝纖維化進展迅速，是眾多因素參與的復雜過程，包括肝星形細胞（HSC）活化、相關因子的過表達、細胞外基質轉化（Extracellular matrix transformation，EMT）等。致病因素如病毒感染、膽閉素［11］等造成的肝臟損傷和炎癥，在多種炎性因子的參與下，可激活肝星形細胞，合成、分泌大量的細胞外基質蛋白，并產生抑制基質降解的因子，導致肝纖維化甚至是肝硬化。目前研究發現多條促纖維化信號通路參與該過程：包括TGF-β/Smad、Notch、Rho/ROCK、MAPK和P13K信號通路等［12］。MMP-7作為多條促纖維化信號通路的調節蛋白及產物，同時也是各類炎癥因子（如IL-17可通過調節MMP-7的活性而促進腫瘤細胞EMT過程［13］）作用于肝臟的調節因子，其與膽道閉鎖肝纖維化之間的相互作用需加以重視。

3.1 MMP-7在膽道閉鎖患兒中的表達 研究證實，通過對肝纖維化患者進行細胞因子、趨化因子在內的120種血清分析物和蛋白酶檢測后發現，與肝臟無病變的對照組相比，有17種分析物表達呈現明顯的差異，其中差異最大且最具有影響力的為MMP-7，提示MMP-7有可能參與了肝臟纖維化過程［14］。臺灣的一項研究結果顯示：在BA患兒中檢測出MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-13等的表達，發現與同年齡無肝膽疾病的患兒相比，僅MMP-2及MMP-7的表達量增高，且MMP-7的表達是MMP-2的4倍以上，故MMP-7可能是MMPs家族中參與膽道閉鎖進行性肝纖維化及組織重塑的主要因子。此外，研究者運用原位雜交技術發現，MMP-7主要表達于膽管上皮細胞及肝細胞［15］。本研究同樣也觀察到病肝組織的膽管上皮細胞、肝細胞均有MMP-7的沉積，說明在這些部位存在局部MMP-7酶原的活化，表明MMP-7參與了BA肝纖維化過程。

國內有學者應用人類膽道閉鎖肝臟組織的基因組芯片研究發現，MMPs家族多個成員表達顯著異常，包括MMP-7表達上調和MMP-19表達下調［16］。此外，Kerola等［17］通過對Kasai術后自體肝生存的膽道閉鎖患兒進行血清學檢驗及組織活檢發現，MMP-7在基因和蛋白水平均表達升高，且與纖維化程度呈正相關，可作為預后的一個重要標志。同時，動物實驗也發現經恒河猴輪狀病毒感染后的大鼠體內可檢測到高于未感染大鼠近4倍MMP-7 mRNA的高表達，且肝纖維化不同階段MMP-7表達量不同，在進展期肝纖維化中MMP-7的表達顯著增高［18］，因此提出可將MMP-7作為進展期肝纖維化及晚期肝纖維化的重要指標。筆者的研究同樣也證實，隨著肝纖維化程度加重，MMP-7表達量增強，對于纖維化程度較重的移植組，MMP-7蛋白在表達量及表達強度上均高于行Kasai手術時的表達。

3.2 MMP-7表達升高的可能原因 MMPs在肝纖維化過程中的作用存在相互矛盾的兩方面：一方面通過降解正常的肝基底膜成份和促進HSC增生，啟動并加重肝纖維化進程，另一方面又可清除部分變性的ECM，從而減緩肝纖維化進程。本研究發現，對于Kasai術后很快進展成肝硬化門脈高壓而行肝移植手術的膽道閉鎖患兒，其肝組織中MMP-7表達水平明顯高于自體肝生存時間長的患兒。分析其可能的原因主要有以下幾點：（1）TGF-β蛋白在肝纖維化早期（即Kasai手術時）的表達量明顯高于肝纖維化后期（肝移植時）［19］。在肝纖維化早期，TGF-β可激活HSC合成大量的膠原，促進纖溶酶原活化抑制因子及基質金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）的合成，抑制MMPs的合成，從而進一步擴大形成纖維化；同時HSC又可分泌大量的TGF-β，這種自分泌的正反饋機制，使得TGF-β加強肝星狀細胞合成膠原的作用更加明顯。而在肝纖維化后期，TGF-β表達量降低，抑制MMP-7表達的作用減弱，從而導致MMP-7表達增強。（2）肝臟可通過內平衡機制來誘導MMP-7的表達，即在肝纖維化的進程中，隨著Ⅳ型膠原的過度沉積，反饋性地使MMP-7的表達增加。（3）Kasai術后肝臟未能完全解除膽道梗阻及開放膽汁引流，致使淤滯的膽汁持續作用于肝細胞及膽管細胞，從而誘導MMP-7的合成及活化，加速肝纖維化過程。

3.3 MMP-7表達與膽管增生的關系 以往的研究表明，炎癥、感染等因素可使膽管上皮細胞大量增生，增生膽管可通過EMT機制轉化為產生膠原成分的間充質結構，促進了纖維化的進程，可能是導致BA纖維化的重要機制［20］。有文獻報道稱，MMP-7的表達量與Kasai術后膽管增生程度呈正相關（r=0.454，P=0.023）［17］。在本組實驗中，雖然能夠觀察到隨著纖維化加重，膽管細胞表達MMP-7蛋白的強度增加，但并未發現兩者呈明顯相關性，可能與本組樣本例數較少有關。

綜上，MMP-7蛋白表達隨肝纖維化程度加重而增強，在BA自體肝生存時間短的患兒中的表達高于Kasai術時及Kasai術后自體肝生存時間長的患兒，表明其對BA患兒肝纖維化進展具有促進作用，不利于膽道閉鎖患兒Kasai術后自體肝生存。MMP-7可作為一個潛在的治療靶點，以期能夠抑制纖維化，從而達到延長自體肝生存的目的。