CD133與HDAC1在老年晚期胃癌患者組織中的表達及臨床意義

席紅利 黃文瑾 尚彥彥

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院 1檢驗科,廣東 廣州 510095；2放療四科)

外科手術切除并輔以放化療是臨床上常用的胃癌治療方案〔1，2〕，然而，術后復發是導致患者生存率低的主要因素，晚期胃癌患者術后5年生存率低于30%〔3〕，其中老年患者由于全身多器官明顯衰退，身體耐受力較差，其5年生存率通常低于平均值。腫瘤干細胞(CSCs)具有自我更新復制和多向分化等特性，是腫瘤復發的源頭〔4〕。分化抗原簇蛋白(CD)133是造血干細胞的表面標志物，同時也是乳腺癌〔5〕等腫瘤干細胞的重要標志物。表觀遺傳修飾在CSCs分化為腫瘤細胞的過程中扮演重要角色，組蛋白去乙酰化酶(HDACs)是表觀遺傳修飾的關鍵酶，在眾多基因轉錄調控中發揮作用〔6，7〕。研究證實，HDACs抑制劑能夠誘導腫瘤細胞發生周期阻滯，促進腫瘤細胞分化和凋亡，具有抗腫瘤功能〔8〕。本研究探討與CSCs密切相關的CD133和HDACs在術后復發的老年晚期胃癌患者的治療和預后評估中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取廣州醫科大學附屬腫瘤醫院2009年1月至2014年12月收集的老年晚期胃癌患者原發部位腫瘤組織標本75例，所有標本經蘇木素-伊紅(HE)染色后，經3名有經驗的病理醫師確診。患者均存在術后復發，其中，男49例，女26例，年齡60～87〔平均(71.32±6.58)〕歲；腫瘤分期：T3～T4a期27例，T4b期48例；淋巴轉移：N0～N2期31例，N3期44例；無肝臟轉移(H0)23例，有肝臟轉移(H1)52例；無腹膜轉移(P0)19例，有腹膜轉移(P1)56例；無遠處轉移(M0)11例，有遠處轉移(M1)64例；分化程度：分化21例，未分化54例。患者均有完整的臨床資料，患者及其家屬對本研究知情同意。本研究符合醫院倫理委員會的相關規定，且已通過委員會的審核。

1.2試劑與方法 兔抗人CD133多克隆抗體(ab19898，美國Abcam公司)，兔抗人HDAC1多克隆抗體(ab19845，美國Abcam公司)，SP試劑盒(上海康朗生物科技有限公司)；3，3-二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。采用免疫組織化學法(IHC)檢測CD133和HDAC1蛋白在癌組織中的表達水平。癌組織標本均采用4%中性甲醛固定，后進行常規的石蠟包埋、切片。取石蠟切片，進行常規的脫蠟至水，置入3%的過氧化氫(H2O2)中，室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，采用微波爐進行抗原熱修復，滴加正常山羊血清，在室溫下封閉20 min，棄去血清，滴加稀釋好的一抗(CD133，HDAC1的稀釋比例均為1∶100)，在37℃的環境下孵育2 h，PBS洗滌，滴加生物素二抗(稀釋比例1∶200)，在室溫下孵育30 min，PBS洗滌，DAB顯色，反復沖洗，蘇木素復染，中性樹脂封片。

1.3結果判定 癌組織標本均選擇10個含有陽性細胞的高倍視野(×400)分別計數100個細胞，取其平均值計算陽性細胞百分率。陽性細胞百分率得分標準如下：<5%為0分；5%～24%為1分；25%～49%為2分；50%～74%為3分；≥75%為4分。染色程度的得分標準如下：無陽性著色為0分；淺黃色為1分；深黃色為2分；棕黃色為3分。最終得分為陽性細胞百分率得分與染色強度得分的乘積：分值為0～12分，若最終得分≥6分則判定為陽性，<6分則判定為陰性。

1.4統計分析 應用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗、Kaplan-Meier生存曲線法、Log Rank檢驗、受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結 果

2.1CD133和HDAC1蛋白在晚期胃癌組織中的表達 CD133蛋白的表達主要定位在細胞質，HDAC1蛋白主要定位在細胞核。CD133蛋白在晚期胃癌組織中的陽性表達率為76.00%(57/75)，而HDAC1蛋白在晚期胃癌組織中的陽性表達率為53.33%(40/75)，晚期胃癌組織中CD133蛋白陽性表達率顯著高于HDAC1蛋白(χ2=3.014，P=0.015)，見圖1。

圖1 晚期胃癌組織中CD133和HDAC1蛋白表達(×400，IHC)

2.2CD133和HDAC1蛋白表達與老年晚期胃癌患者的臨床病理特征的關系 老年晚期胃癌患者組織中，CD133蛋白表達與腫瘤分期、局部淋巴結轉移、肝臟轉移及腹膜侵襲均顯著相關(均P<0.05)，而與有無遠處轉移和腫瘤分化程度無顯著相關性(均P>0.05)；HDAC1蛋白表達與腫瘤分期、局部淋巴結轉移、肝臟轉移、腹膜侵襲及遠處轉移均無顯著相關性(均P>0.05)，與腫瘤分化程度顯著相關(P<0.05)，見表1。

表1 晚期胃癌組織中CD133和HDAC1陽性表達與臨床病理特征的關系〔n(%)〕

2.3晚期胃癌組織中CD133和HDAC1蛋白表達與患者生存預后的關系 以生存資料繪制Kaplan-Meier生存曲線，結果顯示：CD133陽性表達組(57例)平均術后生存時間為(17.21±1.04)個月，CD133陰性表達組(18例)的平均術后生存時間為(25.83±4.38)個月，兩組平均術后生存時間比較差異有統計學意義(χ2=8.614，P=0.030)；HDAC1陽性表達組(40例)的平均術后生存時間為(30.89±2.94)個月，HDAC1陰性表達組(35例)的平均術后生存時間為(26.675±2.52)個月，兩組平均術后生存時間比較差異無統計學意義(χ2=1.909，P=0.167)，見圖2。

2.4CD133和HDAC1蛋白表達水平對生存預后的ROC曲線分析 以生存12個月作為預后判斷因變量，將75例樣本按CD133和HDAC1蛋白的染色指數分別分成0、1～2、3～5、6～8、9～12等5個組段，進行ROC曲線分析。結果顯示，預后判斷閾值點為：CD133蛋白染色指數=3(理論閾值=2.9，敏感度0.742，特異度0.763)、HDAC1蛋白的染色指數=4(理論閾值=4.6，敏感度0.525，特異度0.513)。提示：胃癌患者CD133蛋白和HDAC1蛋白的染色指數分別高于3和4之后，其12個月生存概率將明顯下降。CD133、HDAC1指標的ROC曲線的曲線下面積(AUC)分別為0.784，0.557，提示可能有一定的生存預后價值，但HDAC1蛋白的生存預測價值較低。見圖3。

圖2 CD133和HDAC1蛋白表達與患者術后生存時間的關系

圖3 CD133和HDAC1蛋白的染色指數對胃癌患者生存12個月的預測價值分析(ROC曲線)

3 討 論

胃癌是發病率最高的消化道腫瘤，死亡率僅次于肺癌，好發于50歲以上人群，近年來隨著我國老齡化進程加快，胃癌患病率呈上升趨勢〔9〕。近年來，我國胃癌的整體治療效果已取得突破性進展，其中胃癌根治切除術，已經成為胃癌患者的標準術式〔10〕，然而胃癌患者的術后預后并不樂觀，尤其是晚期胃癌患者，術后復發是導致晚期胃癌患者不良預后甚至死亡的主要原因。CSCs與正常干細胞相似，具有自我更新復制、潛在多向分化及歸巢功能等，是導致腫瘤發生、轉移及復發的根源。近幾十年來，針對CSCs的研究進展迅速，探究CSCs表面標記分子在腫瘤形成、侵襲轉移及化療耐藥中的作用，是目前的研究熱點〔11〕。

CD133又名Prominin-4，是由PROM1基因編碼的含有5次跨膜結構的糖蛋白。研究表明，CD133特異性表達于多種腫瘤的CSCs表面，且CD133過表達常常與腫瘤患者的不良預后相關〔12〕。本研究發現CD133高表達可能與胃癌患者的術后復發相關，Liu等〔13〕研究也發現，局部誘導CD133表達，能夠促使肝細胞癌復發。本研究結果提示CD133可能參與并且增強了胃癌細胞的侵襲遷移能力，促進胃癌的惡性進展，與Ishiwata〔14〕在肝癌細胞中的研究結果一致，CD133陽性表達細胞比CD133陰性細胞具有更強的侵襲能力。本研究提示CD133表達陽性，術后生存時間更短，預示著患者的不良預后，Lu等〔15〕在胃癌中的研究結果也發現，CD133陽性表達胃癌患者的預后明顯較CD133陰性患者差。

CSCs分化成為腫瘤細胞的過程中，表觀遺傳修飾(如DNA甲基化，組蛋白修飾等)發揮極其重要的作用。甲基化和乙酰化是組蛋白最主要的兩種表觀遺傳修飾方式，組蛋白乙酰化是一種高度動態可逆的共價修飾，HDACs與蛋白乙酰轉移酶(HAT)協同參與維持組蛋白乙酰化平〔16〕。在前列腺癌中，HDAC1過表達是預示腫瘤復發、增殖和基因組不穩定的獨立指標〔17〕，在胃癌細胞中，HDAC1能夠抑制p21轉錄翻譯，進而促進胃癌細胞增殖〔18〕，對HDAC1表達水平的檢測，有助于對胃癌患者進行預后評估〔19〕。Sudo等〔19〕在胃癌中關于HDAC1的研究結果顯示，HDAC1高表達與胃癌高惡性程度密切相關，可以作為患者預后預測的靶標，而本研究與其結論并不一致，可能是樣本例數較少、研究對象為術后復發的老年晚期胃癌患者等因素的限制，后期研究將增加樣本數量，進行大樣本分析，以得到更為可靠的結論。

綜上所述，CD133蛋白在晚期胃癌中異常高表達，檢測其表達水平對老年晚期胃癌患者的術后治療和預后判斷具有一定的意義。