醬油風味物質檢測方法研究進展

陳亮，賀博，康文麗，吳燦，周尚庭

(加加食品集團股份有限公司,湖南 長沙, 410600)

醬油起源于中國，已經有2 700多年的歷史[1]；它是中國以及亞洲其他國家(如日本、韓國、泰國)乃至世界上比較重要的調味品之一[2]。醬油香氣的好壞是衡量醬油質量的重要感官指標之一，因此對醬油香氣的研究引起了很多學者的關注。日本是研究醬油香氣最早的國家，有文獻報道早在1887年就開始研究醬油的香氣[3]，1940年KIHARA在《日本化學會志》上發表了關于醬油香氣的文章，從醬油中鑒定出來的香氣成分有乙醇、乙酸、乙酸乙酯、麥芽酚、乳酸異戊酯、乳酸、丙交酯[4]。1955年第一臺商品氣相色譜儀的推出以及其在醬油研究中的應用，加速了醬油中揮發性風味成分的鑒定；到1977年日本學者就發表了30多篇關于醬油風味分析的文章，從醬油中鑒定出的揮發性成分有200多種[5]，至今日本學者對醬油的風味研究也沒有停止[6]。從檢索到的文獻看，我國對醬油的風味研究也較早，在1953年就已經有文獻報道了測定醬油中揮發性酸、酯、醛、乙醇、3-羥基丁酮和2,3-丁二酮的方法[7-8]，到1980年已經采用氣相色譜儀研究醬油中的揮發性風味成分[9]；隨著氣相色譜儀、氣相色譜-質譜聯用儀的普及，國內關于醬油中揮發性風味物質的研究從2008年以后開始增多。本文從醬油中揮發性風味成分的提取方法、醬油中揮發性風味成分定性與定量方法、醬油中鑒定出來的關鍵揮發性風味物質進行歸納總結，指出目前國內研究醬油中揮發性風味成分存在的問題，期望對從事醬油風味研究的人員有一定的參考價值。

1 醬油中揮發性風味成分的提取方法

要想對醬油中的揮發性風味物質進行分析，首先需要將它們從醬油中提取出來，目前報道的提取醬油中揮發性成分的方法有以下幾種。

1.1 溶劑直接萃取

溶劑直接萃取法就是采用溶劑對醬油中的揮發性成分進行萃取，由于醬油也是液體的，所以該方法在萃取醬油中的揮發性成分時也稱為液液萃取，可以直接采用分液漏斗進行萃取[10]，也可以采用特制的玻璃儀器進行連續液液萃取[11]，常用的溶劑是乙醚、二氯甲烷或它們的混合物[12-14]；其優點是通過選擇溶劑，可以將醬油中的各類揮發性風味成分提取出來；缺點是提取過程中也會將醬油中的難揮發或不揮發性成分(如色素、氨基酸、蠟)提取出來，采用氣相色譜或氣-質聯用對提取物進行分析時，為了延長色譜柱的使用時間，需要對提取物進一步處理，去除那些難揮發或不揮發性成分。趙謀明等采用二氯甲烷為溶劑萃取了2種不同淀粉質制得的醬油中的揮發性成分，提取物經過濃縮、有機膜過濾后進行GC-MS分析，從兩種醬油中各鑒定出60種成分[13]。

1.2 同時蒸餾萃取

同時蒸餾萃取法是20世紀70年代由POLLIEN等設計的[15]，該方法的優點是集蒸餾與萃取于一體，操作簡單，所用溶劑量少；該方法的缺點是不適合提取對熱不穩定的揮發性成分，同時由于提取過程中加熱，也會生成一些樣品中不存在的成分；為了解決這個問題，可以在減壓條件下進行同時蒸餾萃取，但是采用冷凝效率更高的冷凝器。劉巍等采用常壓同時蒸餾萃取的方法提取了市售醬油中的揮發性成分，經氣-質聯用儀分析，從中鑒定出了50種成分，含量較高的有乙醇、糠醇、苯乙醛等[16]；馮笑軍等采用同時蒸餾萃取的方法提取了天然釀造醬油與配制醬油中的揮發性成分，在4種不同工藝生產的醬油中共鑒定出了51種成分，其中釀造醬油中酸、醇、酚、醛酮、酯類物質的種類均比配制醬油多，配制醬油中體現烤香的吡嗪類化合物比較豐富，構成醬油特征香氣成分的4-乙基愈創木酚、糠醇、糠醛等物質的含量在配制醬油中相對含量也較低[17]。泰國學者采用減壓同時蒸餾萃取的方法提取了泰式醬油中的揮發性成分，經氣-質聯用儀分析，從兩種醬油中鑒定出了53種成分，其中相對含量較高的有異戊醇、乳酸乙酯、苯乙醇、糠醇等[2]；高獻禮等也采用這種方法提取了廣東產高鹽稀態醬油揮發性風味物質，提取物經氣-質聯用分析儀鑒定出了44種成分[18]。

1.3 吹掃捕集

吹掃捕集法也稱為動態頂空技術，是用流動的惰性氣體將樣品中的揮發性成分吹掃出來，用一個捕集器將吹掃出來的揮發性成分進行吸附，然后將被吸附的成分經熱解吸送入氣相色譜儀或氣-質聯用儀進行分析。通過此方法提取得到的成分都是能夠揮發的，但是由于吹掃效率受到多重因素的影響(吹掃溫度、吹掃氣的流速、吹掃時間、捕集效率等)，且需要專用的儀器，近年來該方法在提取醬油中的揮發性成分使用較少。泰國學者采用該方法提取了泰式醬油中的揮發性成分，經氣-質聯用儀分析，從兩種醬油中鑒定出了50種成分，其中相對含量較高的有異戊醇、乙醇、異丁醇、丁醇等[2]；而采用該方法從另外兩種醬油中檢測到27種物質，其中18種具有香氣活性[1]。韓國學者采用該方法研究了韓式醬油在發酵過程中揮發性成分的變化情況，共鑒定出62種成分，其中在發酵的起始階段醇類、酮類、吡嗪類含量較高，隨著發酵工程的進行，酸類和醛類的含量升高[19]。

1.4 溶劑輔助風味成分蒸發

溶劑輔助風味成分蒸發(solvent-assisted flavor evaporation, SAFE)是1999年由德國ENGEL研究團隊發明的[20]，首先采用溶劑對樣品中的風味成分進行提取，然后利用高真空系統(壓力為10-5mbar)和低溫冷凝(用液氮)將提取物中的揮發性成分與非揮發性成分進行分離。該方法的優點是提取與分離揮發性成分的過程中沒有對樣品進行加熱處理，得到的提取物能真實反映出樣品中的揮發性成分組成，目前該方法是國際上公認的提取揮發性成分最好的方法。由于該方法需要使用高真空系統，相對其他提取方法設備成本較高，國內使用較少。德國SCHIEBERLE團隊用乙醚萃取了日本醬油中的風味成分，所得提取物經SAFE處理得到醬油中的揮發性成分，所得揮發性成分經過進一步處理得到酸性組分和中堿性組分，經過氣相色譜-嗅聞儀(gas chromatography olfactometry,GC-O)分析和香氣萃取物稀釋分析(aroma extract dilution analysis, AEDA)，共鑒定出香氣稀釋因子(FD因子)>于8的香氣活性物質有30種[21]。日本學者用二氯甲烷為溶劑，采用同樣的方法研究了5種市售醬油中的關鍵香氣成分和生醬油經過加熱以后香氣活性物質的變化情況，其中從5種市售醬油中鑒定出的關鍵香氣成分有25種，含量較高的有苯乙醛、異戊酸、麥芽酚、苯乙酸和呋喃酮類成分，醬油經過加熱以后4-乙烯基愈創木酚和2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚的含量增加較多[22-23]。

1.5 固相微萃取

固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)是1989年加拿大Waterloo大學PAWLINSZYN團隊發明的，1993年Supelco公司進行了固相微萃取裝置的商品化工作，該技術集萃取、濃縮、解吸、進樣于一體，具有操作簡單、樣品用量少、不用溶劑、使用成本低、敏感、快速、可實現自動化等優點，現在已被廣泛應用于食品、生物、醫學、環境等領域中的提取揮發性成分[24-25]；但是由于起到萃取作用的纖維對醬油中風味物質的萃取都具有一定的選擇性，采用不同纖維進行萃取時鑒定出的成分有所不同，定量結果相差較大。2008年以后開始用于提取醬油中的揮發性成分，近10年中發表的關于醬油中的揮發性成分的中文文獻中有70%以上(英文有60%以上)用到該方法作為揮發性成分的提取方法。由于起到萃取作用的是涂在石英絲表面的涂層，而不同材質的涂層對揮發性成分都具有一定的選擇性，所以所得分析結果與樣品實際存在的揮發性成分之間存在一定差別；采用該方法作為揮發性成分的提取方法進行定量時，如果不采用穩定同位素稀釋方法進行定量，很難得到準確的定量結果(尤其是面積歸一化法的定量結果極其不準)。陶文沂團隊采用該方法提取了日本醬油中的揮發性成分，對提取條件進行了優化，經氣-質聯用分析，利用質譜定出了97種成分[26]；同時也對自制的低鹽固態和高鹽稀態工藝所得釀造醬油中的揮發性成分進行了提取與分析[27]。趙謀明團隊也采用了固相微萃取及其他提取方法對發酵6個月的醬油中的揮發性成分進行提取與分析，共鑒定出147種成分，其中從固相微萃取所得提取物中鑒定出60多種揮發性成分[18]；利用固相微萃取提取了低鹽固態和高鹽稀態醬油中的揮發性成分，提取物經氣相色譜-嗅聞儀聯用分析，分別從低鹽固態和高鹽稀態醬油中鑒定出33個和37個香氣活性區域，經過調整分流比進行AEDA，發現3-甲基丁醛、苯乙醛和丙酸乙酯在低鹽固態醬油中有較高的FD因子，而乙醇、3-甲基丁醇、苯乙醛、4-乙基-2-甲氧基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚和3-甲硫基丙醛在高鹽固態醬油中有較高的稀釋因子[28]。日本的ETSUKO團隊采用固相微萃取的方法對日本醬油中的果香成分進行了研究，發現2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和4-甲基戊酸乙酯具有較高的FD因子，并且2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和3-甲基丁酸乙酯的含量較高[29]。

1.6 其他提取方法

除以上常用的提取醬油中的揮發性成分的方法外，還有蒸餾法和頂空取樣法。

蒸餾法就是通過蒸餾將醬油中的所有揮發性成分蒸餾出來(包括水)，然后再采用溶劑萃取餾出物中的香氣成分，所得提取物經過濃縮后進行分析；蒸餾過程可以在常壓下進行[30]，也可以在減壓下進行[31]，早期研究醬油中的風味成分時也采用先萃取后蒸餾的方法[4]；這種方法既需要蒸餾又需要萃取，且提取過程中需要加熱，導致揮發性成分發生變化，目前該方法被使用得越來越少。

頂空取樣法在早期分析醬油的揮發性成分時使用較多，就是用氣密性注射器抽取頂空中的氣體進行分析[9]，主要用于分析醬油中的低沸點呈香物質，如乙醛、乙酸甲酯、異丁醛、乙醇、異戊醇、異丁醇、異戊醛和2,3-丁二酮[32]。該方法的缺點是抽取到的頂空氣體中揮發性風味成分含量低，在進行氣相色譜或氣-質聯用分析時給出的響應值低，不便于定性與定量，逐漸被固相微萃取法所代替；但是該方法與固相微萃取法相比，得到的樣品能真實地反映頂空氣的組成。隨著冷柱頭進樣口的商業化以及檢測器種類增多與檢測器檢測限的降低，頂空取樣法作為提取揮發性成分的方法之一再次引起研究人員的重視[33]，頂空自動進樣裝置技術成熟也會推動該方法的應用[34]。

2 醬油中揮發性風味成分定性與定量方法

采用不同的前處理方法將醬油中的揮發性成分提取出來以后，就需要對提取物中的成分進行定性與定量分析，早期主要采用化學分析的方法進行分析，之后采用氣相色譜儀進行分析，如今主要采用氣-質聯用儀進行分析。

定性方法主要包括標準品、質譜、保留指數和香氣特征。在4種定性方法中，最準確的是采用標準品進行定性，但是有的標準品不易市購，有的價格較高。由于氣-質聯用儀本身帶有質譜數據庫，所以采用質譜定性最簡單；但由于一些同分異構體的質譜圖幾乎相同(如二丙基二硫醚和二異丙基二硫醚)，采用質譜定性有時存在一定局限性。采用保留指數定性相對也較簡單，但是有的物質的保留指數不一定有文獻報道值，且不同儀器測得的值有一定的偏差。采用香氣特征進行定性時，需要有嗅覺檢測器，且嗅聞人員需要經過訓練，主要用于檢測是否具有香氣的成分。因為每種定性方法都存在一定的局限性，所以嚴格來說應該至少采用2種定性方法對揮發性成分進行定性。在早期采用氣相色譜儀對醬油中的揮發性風味成分進行分析時，鑒定出來的成分較少，主要采用標準品定性；1990年我國開始有采用氣-質聯用儀分析醬油中的揮發性風味成分的文獻報道[35]，2007年以后隨著氣-質聯用儀在國內的普及，目前國內主要采用質譜對醬油中的揮發性風味成分進行定性，而采用標準品定性的中文文獻極少；采用保留指數對醬油中的揮發性風味成分進行定性的文獻報道較少，近兩年才見文獻報道[36]。使用氣相色譜-嗅聞儀(GC-O)對醬油中的揮發性成分的香氣進行嗅聞，利用未知組分的香氣特征，可以對其進行初步定性，這種方法在國外已經使用十多年，而國內近年來也開始使用。

目前國內對醬油中的揮發性風味成分進行定量時所采用的方法有面積歸一化法、內標半定量法和外標法[30]，在這3種方法中，面積歸一化法用得最多，因為該方法最簡單，但是定量結果極其不準；內標半定量法比面積歸一化法要準確，但是比外標法準確性要差；國內文獻報道的內標法所采用的內標物有2-辛醇[26]、3-辛醇[37]、2-甲基-3-庚酮[13]、環己酮[38]、乙酸正戊酯[39]、庚酸甲酯[40]。英文文獻中報道的定量醬油中揮發性風味成分的主要方法是內標半定量法、內標標準曲線法[27]、標準加入法[29]，3種方法中，最準確的是標準加入法，但是對實驗條件和實驗操作要求較嚴格；英文文獻中所采用的內標有2-辛醇[22]、2-甲基-3-庚酮[2]、丙烯酸[41]、2-乙基丁酸[2]、2,4,6-三甲基吡啶[2]、2-乙酰基吡啶[41]、2-乙基丁酸乙酯[29]、3-甲基戊酸乙酯[41]。

3 目前國內研究醬油中揮發性風味成分存在的問題

從醬油中鑒定出來的揮發性成分已經超過300多種[42]，對醬油香氣有貢獻的應該是關鍵香氣成分，而目前國內的研究還主要集中在提取與分析揮發性成分上。為了發現醬油的關鍵香氣成分，研究中應該采用分子感官科學的方法，從篩選樣品中的香氣活性成分開始，即采用GC-O分析樣品。

在對醬油中的揮發性風味成分進行提取時，大多數都采用了一種提取方法；由于每種提取方法都有其自身的優點和缺點，采用一種方法很難將醬油中存在的揮發性成分全部提取出來，因此應該采用2種優勢互補的方法來提取。目前國際上比較認可的提取方法是SAFE與頂空取樣(或SAFE與SPME)相結合。

在定性方面，國內90%以上都只采用質譜一種方法來定性，定性結果不夠準確；食用香料香精工業國際組織(IOFI)的分析方法工作小組就鑒別風味物質所做的聲明中提到，至少應該采用2種方法對風味成分進行定性[43]，這也是一些SCI收錄期刊所遵循的原則。在定量方面，多數采用面積歸一化法進行定量，只有少數采用內標半定量(其中又只有極少數測定了內標物與被定量成分的相對校正因子[37,44])，定量結果參考價值很低。目前國際上已經采用穩定同位素對風味成分進行定量分析，而國內只是剛剛起步[45]。

在進行GC-O分析時，經常遇到能夠嗅聞到強度很大且FD因子較高的香氣，但是由于它們在檢測器上沒有響應，不能給出明顯的色譜峰，它們的作用經常被忽略。在研究過程中可采用保留指數、香氣特征對它們進行初步定性，然后采用標準品進行驗證；可參照相關文獻，對它們的含量進行估算[46-47]。

4 展望

醬油是我國的傳統調味品之一，隨著揮發性成分提取技術的不斷發展和現代科學分析儀器的普及，越來越多的研究人員開展醬油的揮發性風味成分的提取、分離與鑒定，研究過程中只要采用分子感官科學的方法，以風味為導向，就能鑒定出醬油中的關鍵香氣成分，發現導致不同來源的醬油整體風味差別的主要原因，研究結果可以為企業的生產工藝改進、菌種篩選、品質控制提供理論依據和指導作用。