離子色譜法檢測嬰幼兒配方奶粉中低聚半乳糖含量

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南長沙410007）

低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，其分子結(jié)構(gòu)一般是在半乳糖或葡萄糖分子上連接1～7個半乳糖基，即Gal-（Gal）n-Glc/Cal（n為0～6）[1-2]。GOS少量存在于動物乳汁中，而在人體母乳中較為豐富，可以有效促進(jìn)嬰兒體內(nèi)雙歧桿菌群的增殖，還具有防止骨質(zhì)減少、改善脂質(zhì)代謝、改善礦物質(zhì)元素吸收、預(yù)防治療便秘、改善營養(yǎng)狀況、增強免疫力等營養(yǎng)功能[3]。

目前，GOS的安全性已經(jīng)被廣泛認(rèn)可，成為食品及乳制品領(lǐng)域研究熱點[4-6]。中華人民共和國衛(wèi)生部公告2008年第20號已批準(zhǔn)GOS為新資源食品，可以在嬰幼兒乳制品及食品中添加，食用量≤15 g/d[4]。目前，低聚半乳糖作為重要益生元，在市面很多奶粉中均有添加，含量從幾百到幾千毫克每百克不等。

低聚半乳糖是由一系列半乳糖基低聚糖組成的混合物，聚合度從2至8不等，目前可以分離并確定結(jié)構(gòu)的低聚半乳糖組分已達(dá)15種[7]。鑒于結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，以現(xiàn)有技術(shù)無法制備所有結(jié)構(gòu)組分的標(biāo)準(zhǔn)品，用于每種低聚半乳糖的定量。目前，有關(guān)低聚半乳糖的分析研究多采用酶解法，研究對象主要集中于轉(zhuǎn)化酶產(chǎn)物、糖漿、米粉樣品及液態(tài)奶等[8-15]乳糖含量低的樣品。如楊曉波等[8]對嬰幼兒米粉中低聚半乳糖的測定進(jìn)行了研究；張志國等[11]采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定液態(tài)奶中低聚半乳糖含量，但液相色譜-蒸發(fā)光散射方法存在分離效果差、檢測靈敏度低的缺點；鄭惠玲等[12]闡述了離子色譜法測定低聚半乳糖原料中乳糖、葡萄糖、半乳糖及低聚半乳糖的含量，對方法回收率及檢出限進(jìn)行了探討。

因為基于美國AOAC 45.4.12-2001.02《選定食品產(chǎn)品中反式低聚半乳糖的測定》方法[15]的酶解法，定量依據(jù)是酶解試樣中半乳糖的增量，所以待測試樣中乳糖含量是影響定量檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的最主要因素（該標(biāo)準(zhǔn)已進(jìn)行相關(guān)說明）。已有相關(guān)文獻(xiàn)報道[8]，當(dāng)樣品中乳糖量低于低聚半乳糖量的3倍時，酶解法才能有較好的精密度及回收率。嬰幼兒配方奶粉中乳糖含量一般在50 g/100 g左右，通常GOS添加量小于5 g/100 g，由GOS酶解得到的半乳糖較由乳糖酶解得到的半乳糖低很多，可忽略為從儀器分析及樣品前處理所產(chǎn)生的誤差，因此該方法不能直接準(zhǔn)確檢測嬰幼兒奶粉中低聚半乳糖的含量。

本研究首先是采用酶解法，對嬰幼兒配方奶粉同批次GOS原料進(jìn)行前處理分析，采用靈敏度高的離子色譜-電化學(xué)脈沖安培檢測器測定原料中GOS含量（GOS原料通常含有乳糖、葡萄糖、半乳糖等其他成分），再依據(jù)原料和嬰幼兒配方奶粉中各聚合度低聚半乳糖配比一致的原理，選擇一組GOS特征峰，以該同批次原料糖漿作為對照品，間接測定嬰幼兒配方奶粉中GOS含量。該方法為嬰幼兒配方奶粉中低聚半乳糖的檢測提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

ICS-3000離子色譜儀（AS-DV自動進(jìn)樣器、四元梯度泵、電化學(xué)脈沖安培檢測器，變色龍6.8色譜工作站）：賽默飛世爾科技公司；SHZ-W恒溫振蕩器：常州萬順儀器制造有限公司；SI-234電子天平：美國丹佛儀器公司；Milli-Q超純水儀：德國默克密理博公司；BXM-30R高壓滅菌鍋：上海博訊公司；TD-6高速離心機：萬和儀器制造公司；VGT超聲波清洗機：廣東固特公司。

1.1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)品D-葡萄糖（純度99.5%）、D-果糖（純度99.6%）、半乳糖（純度 99.9%）、蔗糖（純度 99.5%）：德國 Dr.Ehrenstorfer；β-半 乳 糖 苷 酶 （240 U/mg）：Megazyme公司；乙腈（色譜純）、無水乙酸鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、三水磷酸氫二鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：國藥集團；50%氫氧化鈉（色譜純）：戴安公司；C18 固相萃取小柱（500 mg；3 mL）：艾杰爾公司；低聚半乳糖糖漿原料、同批次奶粉、低聚半乳糖奶粉空白：奶粉企業(yè)提供。

1.1.3 試劑配制

磷酸鹽緩沖溶液（20 mmol/L，pH 6.0）：準(zhǔn)確稱取6.0 g三水磷酸氫二鉀和22.0 g磷酸二氫鉀，溶解稀釋至1 L，高壓滅菌器中120℃滅菌30 min，備用。

β-半乳糖苷酶溶液（2 000 U/mL）：取 240 U/mg的半乳糖苷酶，用磷酸緩沖溶液配成2 000 U/mL的溶液，冷凍保存。

乙酸鋅溶液（300 mg/mL）：稱取30.0 g乙酸鋅，水溶解定容至100 mL。

亞鐵氰化鉀溶液（150 mg/mL）：稱取15.0 g亞鐵氰化鉀，水溶解定容至100 mL。

鹽酸溶液（2.5 mg/mL）：量取22.5 mL，水稀釋定容至100 mL。

氫氧化鈉溶液（2.5 mg/mL）：稱取10 g氫氧化鈉，加50 mL水溶解，冷卻后定容至100 mL。

氫氧化鈉溶液（200 mmol/L）：取10.4 mL 50%氫氧化鈉溶液，用水稀釋到1 000 mL，通入氮氣保護(hù)，緩慢混勻，室溫下可放置7 d。

氫氧化鈉（150 mmol/L）和乙酸鈉（500 mmol/L）混合溶液：稱取41 g無水乙酸鈉（精確至0.01 g），用500 mL水溶解，0.45 μm濾膜過濾，脫氣，加入7.8 mL 50%氫氧化鈉溶液，并用水稀釋至1 000 mL，通入氮氣保護(hù)，緩慢搖勻，室溫下可放置7 d。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量乳糖、葡萄糖和半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，配制成含量分別均為1.0 mg/mL的儲備液。分別吸取適量儲備液，用水稀釋定容至100 mL，配成5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL工作液，離子色譜儀進(jìn)行測定分析。以乳糖、葡萄糖和半乳糖峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料糖漿分析

稱取原料糖漿試樣約0.1 g，加入40 mL加熱至60℃的磷酸鹽緩沖液，超聲10 min，混勻溶解，轉(zhuǎn)移并定容至100 mL，為試樣液。取25 mL容量瓶，加入1 mL磷酸鹽緩沖液和1 mL β-半乳糖苷酶溶液，置于100℃水浴加熱20 min，使酶失活，冷卻室溫后準(zhǔn)確加入2.5 mL試樣液，標(biāo)記為酶解樣A。另取25 mL容量瓶，加入1 mL磷酸鹽緩沖液和1 mLβ-半乳糖苷酶溶液，準(zhǔn)確加入試樣液2.5 mL，標(biāo)記為酶解樣B。A、B同時置于60℃水浴振蕩酶解60 min，冷卻后純水定容至25 mL，混勻。取上清液過C18固相萃取小柱及0.22 μm濾膜，采用離子色譜法測定原料樣中低聚半乳糖含量。酶解樣A測定游離乳糖、葡萄糖和半乳糖含量，酶解樣B測定葡萄糖和半乳糖總含量。原料樣中低聚半乳糖含量結(jié)果按以下公式計算[12-15]。

式中：GB為經(jīng)β-半乳糖苷酶酶解反應(yīng)后半乳糖總含量，%；GA為樣品中游離的半乳糖含量，%；GL為樣品中乳糖水解產(chǎn)生的半乳糖含量，為樣品中游離乳糖含量除1.9[12]，%；k為半乳糖轉(zhuǎn)換為低聚半乳糖的轉(zhuǎn)換系數(shù)，無量綱。

式中：n為低聚半乳糖平均聚合度。

1.2.2 奶粉樣品前處理優(yōu)化

對嬰幼兒奶粉中蛋白質(zhì)的去除，進(jìn)行方法學(xué)考察，分別是乙腈沉淀蛋白、調(diào)pH值沉淀蛋白、沉淀試劑（乙酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液）沉淀蛋白，分別在1.0、2.0、4.0 g/100 g 3個水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。

1.2.3 奶粉成品分析

稱取0.5 g嬰幼兒配方奶粉樣品（精確至0.1 mg），加入4 mL熱水（約60℃）溶解，超聲提取20 min，乙腈定容至10 mL，混勻，3 000 r/min離5 min，取上清液1.0 mL，用水稀釋至10 mL，過C18凈化小柱及0.22 μm濾膜后，進(jìn)行離子色譜分析。

以糖漿原料為對照品，配制成GOS濃度為25.0、50.0、100、250、500 μg/mL 的對照品工作液，通過比較原料對照品、同批次GOS奶粉樣品及GOS空白奶粉樣品圖譜，選取1組某聚合度的GOS特征峰，依據(jù)原料和同批次嬰幼兒配方奶粉中各聚合度低聚半乳糖配比一致的原理，采用外標(biāo)法定量計算產(chǎn)品中低聚半乳糖總含量。

1.2.4 色譜條件

色譜柱 CarboPacPA20離子色譜柱（3mm×150mm，6.5 μm）；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 10 μL；流速 0.45 mL/min：電化學(xué)-脈沖安培檢測器，Au工作電極，Ag/AgCl參比電極，檢測池溫度30℃，檢測波型（standrad quad）。考慮到試驗操作的便捷性，避免頻繁更換流動相，造成試劑浪費，本次研究參照低聚果糖國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.255-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中果聚糖的測定》，選用氫氧化鈉溶液（200 mmol/L）、氫氧化鈉（150 mmol/L）乙酸鈉（500 mmol/L）混合溶液、水作為流動相，并對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與討論

2.1 原料的GOS測定結(jié)果

采用離子色譜-電化學(xué)脈沖安培檢測器測定混合標(biāo)樣、酶解液（A）、酶解液（B），經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)半乳糖、乳糖及葡萄糖得到很好分離。分析色譜圖如圖1～圖3。

由于不同工藝生產(chǎn)出的低聚半乳糖產(chǎn)品在結(jié)構(gòu)比例上存在一定差異，導(dǎo)致不同類型產(chǎn)品的平均聚合度n不同，從而影響系數(shù)k值大小。利用色譜雙柱法對GOS含量在30%～60%的樣品進(jìn)行分析檢測[16]，可知低聚半乳糖平均聚合度為2.16，得經(jīng)驗換算系數(shù)k為1.36。

繪制半乳糖和乳糖的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，可得出半乳糖線性方程為：y=0.098 65x-0.426 3，R2=0.998 8；乳糖的線性方程為：y=0.093 17x-0.312 6，R2=0.999 1。通過測定酶解樣A中游離乳糖、葡萄糖和半乳糖含量，酶解樣B中葡萄糖和半乳糖總含量，按公式（1）計算GOS含量，結(jié)果如下表2所示，測定結(jié)果平均值為56.1 g/100 g（理論值為57%），RSD為0.64%。

圖1 混合標(biāo)樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of mix standards

圖2 酶解液A色譜圖Fig.2 Chromatogram of enzymatic hydrolysate A

圖3 酶解液B色譜圖Fig.3 Chromatogram of enzymatic hydrolysate B

表2 GOS組分測定結(jié)果（n=3）Table 2 Composition of GOS samples（n=3）

2.2 奶粉樣品前處理優(yōu)化結(jié)果

3種蛋白沉淀加標(biāo)回收率比較見表3，3種蛋白沉淀加標(biāo)回收率比較圖見圖4。

調(diào)pH值沉淀和加沉淀試劑色譜峰形不佳，同時回收率也稍低，故選擇乙腈作為蛋白沉淀劑。由于低聚半乳糖屬于可溶性膳食纖維，高比例乙腈會造成低聚半乳糖萃取效果差、回收率低；如乙腈含量低于50%，蛋白質(zhì)沉淀效果不佳，故選擇60%乙腈沉淀蛋白。

2.3 特征峰的選擇

以由酶解法測得GOS含量的初始原料作為對照密度較好，RSD為3.5%。品，對奶粉成品中GOS進(jìn)行定量分析，特征峰的選擇至關(guān)重要，通過對原料對照品、空白樣品、待測奶粉樣品色譜圖分析，發(fā)現(xiàn)有多組峰可作為參考選擇，本次研究發(fā)現(xiàn)，選擇以11 min附近的色譜峰作為特征峰，可得到較準(zhǔn)確的定量結(jié)果，故作為本次研究的特征峰。原料對照品、空白樣品、待測樣品色譜圖分析結(jié)果如圖5。

表3 3種蛋白沉淀加標(biāo)回收率比較Table 3 Recovery rates of three precipitation methods

圖4 3種蛋白沉淀加標(biāo)回收率比較圖Table 4 Recovery rates of three precipitation methods

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性方程

以已知含量的原料作為對照品，配制系列濃度的低聚半乳糖工作液，不同濃度工作液色譜圖如圖6，通過濃度對特征峰面積的線性擬合，得出GOS線性方程為：y=0.082 5x-0.527 2，R2=0.999 7。

2.5 精密度試驗

按上述樣品分析步驟，對含GOS奶粉樣品平行測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，結(jié)果見表4。由表可知，以原料作為對照品測定奶粉中GOS含量，方法精

圖5 色譜對照圖Fig.5 Chromatogram comparison

圖6 原料對照品系列濃度色譜疊加圖Fig.6 Chromatogram of series raw material

2.6 加標(biāo)回收試驗

加標(biāo)回收選取3個加標(biāo)水平對GOS空白奶粉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，加標(biāo)量分別為1.0、2.0、4.0 g/100 g，按前述樣品處理步驟進(jìn)行處理，每個加標(biāo)水平平行測定3次，試驗結(jié)果見表5。根據(jù)結(jié)果可知，加標(biāo)回收率為87.7%～92.4%，結(jié)果表明，此方法準(zhǔn)確度較高。

2.7 方法檢出限

為考察方法檢出限，本試驗在低水平對GOS空白樣品進(jìn)行加標(biāo)測試，加標(biāo)量為0.25 g/100 g。以低聚半乳糖目標(biāo)峰附近13 min～16 min為噪聲計算范圍，試驗結(jié)果見如下表6。

根據(jù)GB 5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分總則》附錄A.2，色譜儀檢出限為最低響應(yīng)值（S）對應(yīng)的檢出濃度或檢出量，其中S=3N（N為儀器噪聲水平）。由表6可知，在該水平加標(biāo)信噪比S/N為3.2～4.1，滿足要求。本次驗證選擇加標(biāo)量0.25 g/100作為方法檢出限。

表4 精密度試驗結(jié)果Table 4 Results of precision experiment

表5 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果（n＝3）Table 5 Results of recovery rate（n=3）

表6 檢出限試驗結(jié)果Table 6 Results of detection limit test

3 結(jié)論

本次試驗通過采用離子色譜-脈沖安培法，首先檢測低聚半乳糖原料中低聚半乳糖純度，再使用同批次低聚半乳糖原料作為分析對照品，外標(biāo)法測定嬰幼兒奶粉中低聚半乳糖的含量。試驗結(jié)果表明，該方法精密度較好，原料分析RSD 0.64%，成品分析RSD 3.5%，加標(biāo)回收率87.7%～92.4%。此方法降低了成本，對檢測嬰幼兒配方奶粉中的低聚半乳糖，具有較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，為乳糖含量高的產(chǎn)品中GOS檢測方法研究提供一種新思路。