間充質干細胞在宮腔粘連及其他子宮內膜損傷治療方面的研究進展

林慧隆，沈來恩，林琪，邊曉麗，吳雪清

(溫州醫科大學附屬第一醫院，溫州 325000)

宮腔粘連(IUA)第一次是由德國的Fritsch在1894 年報道的，但在1948年，Asherman首次對該疾病進行命名并作詳細描述，因此現在也稱之為Asherman綜合癥(AS)[1]。其主要是由于子宮內膜基底層損傷后修復障礙而導致的宮腔部分或全部粘連閉塞，從而引起月經異常、周期性腹痛、不孕及反復流產等臨床表現。從組織學角度來說，IUA就是內膜基質被纖維組織替代，腺體被不活躍的柱狀上皮替代，后者對激素刺激不敏感。最終子宮內膜結構遭到破壞，導致了子宮功能失常。在起初的50～60年，對宮腔粘連的研究主要集中在其流行病學、病因學和病理學。內鏡技術的發展為其診斷和治療提供了新的手段，目前以宮腔鏡下粘連分解術并輔以雌激素治療作為標準治療手段[2]。Myers等[3]報道了一篇案例，12位重度宮腔粘連的女性在宮腔鏡粘連分解術后輔以雌激素、球囊支架、宮內節育器(IUD)綜合治療后全部恢復了月經周期，并且其中6人成功妊娠。但宮腔粘連術后總體復發率為 3.1%～23.5%，其中重度粘連高達 62.5%[4]。對于重度宮腔粘連子宮內膜大面積損傷的情況下，雌激素很難達到有效的治療作用，因為雌激素發揮作用必須在足夠殘留內膜的基礎之上。而干細胞工程為宮腔粘連的治療開辟了一條新的道路，以往的研究已經證明了其能通過促進子宮內膜再生來治療宮腔粘連[5-7]。但是大樣本數據的缺乏使得無法形成標準化的干細胞治療方案。為普及宮腔粘連的干細胞治療，一系列的問題有待解決，比如干細胞來源問題、劑量選擇、用藥方式等。

一、宮腔粘連概述

子宮內膜可以分為功能層和基底層。生理情況下，功能層在卵巢周期性的激素作用下可發生增生、分化及脫落，再由基底層按周期規律性再生成新的功能層。正常女性生育期可經歷400多個這樣的周期，表明子宮內膜具有再生能力以及較強的容受性。而病理狀態下，基底層修復功能受損時，子宮內膜完整性被破壞，導致宮腔發生形態異常及纖維粘連的形成。其形成機制可能為雌激素受體減少、子宮內膜干/祖細胞異常、細胞因子異常和血管形成障礙等幾方面共同作用[8]。

二、干細胞治療子宮內膜效果的評價指標

為了解子宮內膜修復效果，在動物實驗中已經形成了一系列較為常用的檢查。其中包括病理形態學結果(如子宮內膜厚度、內膜腺體數目、子宮內膜小血管數目及纖維化面積比率等)、免疫熒光檢測(觀察經標記的干細胞在內膜分布情況)、免疫組織化學檢測(如角蛋白、波形蛋白及轉化生長因子的檢測等)、IUA相關基因檢測以及子宮妊娠結局(如胚胎數目等)。

三、不同來源的干細胞治療宮腔粘連

(一)骨髓間充質干細胞(BMSCs)

1.臨床案例：國內外案例報道主要集中在自體骨髓間充質細胞的移植治療上。Nagori等[5]的團隊報道了一例將自體提取的干細胞移植到子宮腔治療重癥宮腔粘連的患者，他們從該患者自身骨髓細胞中分離出39×106個CD9、CD40、CD90陽性細胞移植至子宮腔，最終患者子宮內膜增厚達到胚胎移植的標準，并通過體外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功懷孕。而Singh等[6]則直接將(103.3±20.5)×106個單核干細胞(MNCs)直接移植到6名患者子宮內膜下，而不是分離出特定表型的細胞再移植。結果顯示全部6名患者子宮內膜厚度均較前增加，但未達到理想厚度，其中5名恢復了月經。Santamaria等[7]從外周血中分離出CD133陽性的骨髓來源干細胞，平均數量為124.39×106個，再通過導管自體移植到子宮螺旋動脈中。經過治療后，16個宮腔粘連及子宮內膜萎縮患者中，15個恢復了月經，其中1名患者成功經陰道分娩足月兒，另一個則經剖宮產分娩足月兒。國內Zhao等[9]將攜帶骨髓來源單核細胞的膠原支架放置到子宮腔來治療10個重度宮腔粘連患者，移植的干細胞密度為5×106/cm2，最終有5名患者成功生育。以上臨床案例皆是通過宮腔內移植干細胞來進行治療，細胞數量、用藥途徑存在一定的差別，但宮腔粘連等損傷情況都在一定程度上得到改善。

2.動物實驗：Liu等[10]利用綠色熒光蛋白(GFP)標記BMDCs在子宮內膜物理損傷后的C57BL/6J小鼠模型上進行試驗，分別通過靜脈血注射和宮腔局部注射的方式給予治療，結果發現全身用藥的小鼠子宮內募集了更多的GFP陽性的細胞。該實驗表明全身用藥具有更好的的治療效果，至少在保持損傷部位干細胞濃度上具有一定優勢，其可能原因在于靜脈較宮腔具有更有利于干細胞生長的環境。但靜脈注射干細胞安全性及臨床可行性仍需要進一步進行探索。此外，該實驗也提示了能從提高局部干細胞的活性和濃度的方面入手提高干細胞移植的治療效果，如Yang等[11]就發現，在體外實驗中，維生素C(Vc)能促進Pluronic F-127(PF-127)凝膠包裹的BMSCs的生存及生長，并且在經物理損傷誘導產生的宮腔粘連大鼠模型中證明了BMSCs、PF-127和Vc三者聯合治療能促進子宮內膜修復，這表明Vc和PF-127能為BMSCs創造一個更有利的生存環境，提高其治療作用。而最近Ong等[12]指出并沒有證據表明BMDCs能轉化為子宮內膜上皮、基質細胞或者內皮細胞，該團隊利用更靈敏的檢測手段來檢測子宮內膜的免疫細胞的表型，他們推測之前關于BMDCs能轉化為子宮內膜細胞系的報道其實是錯誤地識別了免疫細胞。這一發現是顛覆性的，因為人們普遍認為BMDCs能直接促進子宮內膜再生，基于此才形成了一系列針對損傷內膜的治療方法。因此，明確這個問題非常重要，未來需要更多的關注該方面研究進展。然而，不論是臨床還是動物實驗都表明BMDCs對于內膜損傷具有一定的修復作用，且患者癥狀確實有改善。這也從側面表明干細胞的治療作用可能不是直接通過分化成為子宮內膜細胞，而更多的是通過分泌的細胞因子起作用。

(二)子宮內膜間充質細胞(eMSCs)

eMSCs作為一種多分化和高增殖潛能的干細胞，能夠像其他干細胞一樣被用于多種學科的再生醫學[13]。已經有證據表明eMSCs能在體外轉化為內膜上皮和基質細胞。同時，相對于健康對照組，宮腔粘連患者的內膜組織中擁有較少的干細胞[14]。目前，能夠通過多種方法從月經血中獲得此類干細胞，故又稱經血干細胞[13，15-16]。其獲取的條件具有重復性和非侵襲性等優點，是良好的間充質干細胞來源。

1.臨床案例：除了BMSCs案例以外，臨床上也有利用eMSCs來治療7名重度宮腔粘連患者的報道。通過宮腔內移植1×106個表現為CD44、CD73、CD90 和 CD105陽性的細胞，最終結果顯示其中的5名患者的子宮內膜增厚達7～8 mm，1名自然懷孕，2名經胚胎移植后成功懷孕[13]。

2.動物實驗：為探究eMSCs在子宮內膜損傷疾病中的的治療機制，Zhang等[17]利用電凝的方式建立子宮內膜損傷的小鼠模型，并通過靜脈注射的方式進行eMSCs移植。研究結果顯示接受移植的小鼠內膜組織厚度及微血管密度相對于對照組均有增加，并且其妊娠結局也有改善。此外還發現源自干細胞的條件培養基能夠通過激活AKT和/或ERK通路減少H2O2誘導的內皮細胞凋亡、促進內皮細胞增殖和遷移能力并能促進新生血管形成。該團隊的另一項研究則在利用95%酒精沖洗宮腔的方式建立SD大鼠子宮內膜纖維化模型，他們發現由eMSCs分泌的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)能夠通過抑制鋅指蛋白GLI2(Gli2)表達來減少內膜的纖維化[18]。而在此之前，竺海燕[19]已經通過細胞體外實驗發現經血干細胞條件培養基能顯著促進eMSCs的增殖，并通過激活Hippo/TAZ通路、抑制轉化生長因子β(TGFβ)的方式減輕纖維化程度。

(三)脂肪組織來源間充質細胞(aASCs)

盡管BMSCs是目前應用最為廣泛的干細胞來源，但其創傷性的收集細胞過程反而加重了病人的痛苦，這點是不可避免的限制。而MSCs的獲取具有重復性和非侵襲性等優點，是良好的BMSCs的替代品。脂肪干細胞有多種分化能力，已經應用很多領域，其易獲取性、倫理爭論小和較小的創傷性使之成為一個理想的干細胞來源。從脂肪提取物中分離而來的干細胞在體外能誘導分化成脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞以及肌細胞等[20]。ASCs的分化潛能和其他間充質干細胞類似，且他們的分離的產量和培養時的增殖速率都要高于BMDCs[21]。針對ASCs的細胞表型分析發現這些細胞表達CD34、73、CD90以及CD105，不表達CD31、CD45[22]。其能分泌一些細胞因子，具有促血管生成、抑制免疫以及抗氧化的作用[23]。但ASCs是否能夠有效修復損傷的子宮內膜、使之恢復正常生理狀態仍具有爭議。目前為止還未見有關脂肪來源干細胞治療宮腔粘連的案例報道。

動物實驗：Kilic等[24]將2×106個CD90、CD44和CD49表達陽性，而CD11b/c、CD45表達陰性的ASCs注射到三氯乙酸誘導的宮腔粘連大鼠的一側子宮角，之后連續3次腹腔內注射，每次間隔5 d。結果顯示有4%～6%的經標記的細胞在子宮組織被發現，同時還觀察到新生血管增多、纖維化面積減少。但在纖維化降低方面，單純干細胞治療組較對照組沒有統計學意義，反而單純雌激素和干細胞結合雌激素治療效果更加明顯。國內的孔德勝[8]利用物理損傷和細菌脂多糖感染的雙重損傷法建立大鼠宮腔粘連模型，通過子宮肌壁間注射和復合小腸黏膜下基質支架(SIS)的方式移植2×106大鼠ASCs。結果發現單純ASCs注射移植無明顯效果，只在后期發現內膜細胞上皮化優于模型組，并且原位注射的宮角后期只可見少量經綠色熒光標記的ASCs存活，至21 d時，只有極少量細胞存在。而SIS復合或不復合ASCs的方式不僅可以改善子宮內膜的病理狀態指標，還可以提高子宮內膜容受性，胚胎數目增加。此外，SIS復合ASCs治療效果較單純SIS治療組效果更佳[8]。這表明該種支架能有利于細胞的生存和生長，以此增加ASCs的治療效果。在這之前，Hunter等[25]就探索過脂肪來源間質血管部分細胞(SVF)能否改善子宮內膜形態和容受性。SVF主要成分是脂肪干細胞。他們利用無水酒精成功誘導形成了SD大鼠薄型子宮模型，并在此基礎上宮腔內注射0.5 ml含有1×106細胞的懸液，結果發現子宮容受性的形態學和功能學上并未顯示有意義的改善，但降低了舒張微血管的緊張度，增加了組織流量。為檢測受體組織中的GFP陽性的SVF細胞分布情況，該團隊還進行了3D共焦成像，發現細胞植入不良，沒有陽性細胞存在。

雖然上述造模方式、給藥方式有些許差異，對實驗造成了一定的影響。但從總體來看，單純原位注射干細胞對于修復子宮內膜效果不佳，其可能原因與干細胞的在宮腔內的保留與植入能力有關。因此如何增強脂肪來源干細胞的活性及生存能力成了至關重要的問題。受上述實驗的啟發，筆者認為可以從增加給藥次數、延長給藥時間、用靜脈注射替代原位注射及聯合一些其他藥物共同治療等方面入手。近年，南方醫科大學南方醫院的魯峰教授團隊發明了一項新專利SVF-gel，即脂肪干細胞膠。其是通過物理方法有效去除脂肪組織中的油滴后，得到的富含脂肪干細胞和細胞外基質(ECM)的產物，后者主要成分是膠原蛋白，彈性蛋白和粘多糖。相對于普通脂肪組織，其保留了大部分ECM，為脂肪干細胞提供了良好的生存環境，增加其生存率。已有實驗證明其在皮膚傷口愈合方面具有促進作用[26]。筆者認為其可能在未來能夠應用于宮腔粘連等纖維化相關疾病的治療。

同時，在脂肪干細胞使用的安全性方面，有團隊嘗試在移植前對其進行γ射線輻射處理，減少其增殖能力，但仍保留了促進子宮內膜再生的能力[27]，這一試驗也從一方面說明干細胞修復機制不完全依賴于自身的增殖分化，其還能夠分泌一些因子來產生作用。

(四)其他來源

除了上述幾種主要來源的干細胞以外，還有報道利用羊膜間充質基質細胞[28]、人早孕蛻膜間充質干細胞[29]、臍帶間充質干細胞[30]等探究干細胞對于宮腔粘連和子宮內膜損傷的治療效果和機制。

四、小結

重度宮腔粘連的治療與預防復發目前仍是難點，而基于干細胞治療的再生醫學為其創造了條件。來源廣泛的干細胞為人們提供了多樣化的選擇，但同時，大樣本數據的缺乏使得無法形成標準化的干細胞治療方案，上述文獻中涉及的造模方式、用藥途徑和用藥劑量都存在一定差異，由此可能產生了不同、甚至相反的結局，以至于無法有效的進行分析比對，未來仍需進行大樣本的實驗。此外，單純移植干細胞的效果并不理想，可能原因在于移植的干細胞受宮腔內環境影響無法產生定植、分泌的效果，因此如何在一段時間內維持和增強細胞的生存和分泌作用需要進行更深入的研究。更為理想的治療方案是分離出有效的細胞因子代替干細胞對宮腔粘連及子宮內膜損傷進行治療，但更全面的機制仍需要進一步的探索。隨著研究的深入進行，基于間充質干細胞的子宮內膜修復和治療將會更加準確、有效。