IL-38及MIP-2在大鼠肺纖維化中的作用①

孫云暉 劉振欣 鮑文華 王一新 牛圓圓

(佳木斯大學附屬第一醫院,佳木斯 154003)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis, PF)是一種慢性進行性發展的肺部疾病，臨床上收入院患者少數有職業粉塵暴露史或結締組織病病史，但大多數病因未明，臨床表現以胸悶氣短、呼吸困難、乏力為主，PF至今無可治愈的藥物，多數此病患者的治療效果較差，病死率高，生活質量嚴重下降。在整個肺纖維化的發生及發展進程中各種細胞因子在炎性細胞的聚集，刺激成纖維細胞活化和增殖，促使膠質成分的沉積等方面發揮著重要的作用[1]。IL-38屬于IL-1家族第10個新成員， 它首先是2001年由 Lin等[2]使用寡核苷酸探針雜交技術和計算機序列分析、發現并鑒定的細胞因子。IL-38與IL-36Ra、IL-1Ra一樣，對炎癥性免疫過程有抑制作用[3]。巨噬細胞炎性蛋白-2(Macrophage inflammatory protein-2,MIP-2)屬于趨化因子C-X-C亞家族成員之一，可由巨噬細胞等多種細胞產生，對中性粒細胞有很強的趨化作用[4]。目前，國內外關于IL-38生物學功能等的研究都尚處于起步階段，關于IL-38與MIP-2在大鼠PF中的關系罕見報道，本實驗通過制備PF動物模型，觀察PF大鼠生理狀態及肺組織病理改變，檢測肺組織IL-38蛋白及MIP-2mRNA的含量，通過探討IL-38、MIP-2在大鼠PF發生、發展過程中的作用及意義，判斷其對PF臨床價值，可以為臨床提供一條新的抗纖維化治療策略。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器及藥物 Applied Biosystems 7300Real Time PCR System(佳木斯大學實驗室提供)；注射用鹽酸博來霉素BLM(海正輝瑞制藥有限公司提供)；HE染色試劑(湖北錦源醫療科技有限公司提供)；Nikon eclipse50i顯微鏡(北京中儀光科科技發展有限公司提供)；IL-38大鼠ELISA試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司提供)；大鼠HYP酶聯免疫分析試劑盒(上海勁馬實驗設備有限公司提供)；RNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；cDNA反轉錄試劑盒及PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

1.1.2實驗動物 成年清潔級Wistar大鼠(雌雄各半)45只，6～8周齡，體重(180～220)g，由哈爾濱醫科大學動物實驗中心提供[許可證號:SCXK(黑)2013-001]，按清潔級標準飼養于佳木斯大學動物實驗中心。在實驗動物喂養及實驗觀察期間，由專人管理，環境、溫度、濕度適宜。

1.2方法

1.2.1分組及模型制備 健康Wistar大鼠應用隨機、對照原則分為3組(n=15)：生理鹽水對照組(N組)、博來霉素組(B組)和地塞米松組(D組)，其中B組和D組統稱為模型組(M組)。M組按照 BLM 4 mg/kg 體積氣管內注射制備纖維化大鼠模型，N組氣管內注射同體積的生理鹽水。地塞米松治療組：第2天開始每天腹腔注射地塞米松注射液 3 mg/kg，其余兩組腹腔注射同體積的生理鹽水作為對照。分別于第 7天、14天、28 天，每組處死大鼠5只，留取肺組織待檢測。

1.2.2肺組織標本的采集 腹腔內注射10%水合氯醛3.5 ml/kg；開胸，肺臟經病理宏觀檢查后，取出兩肺，切取的右肺上葉肺組織固定于10%中性福爾馬林中，于24 h更換福爾馬林液，48 h取出，常規石蠟包埋，蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色后光學顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織切片病理改變情況；切取的其余右肺組織及左肺用濾紙吸干放入Eppendorf管內置于-80℃冰箱保存，分別用于大鼠肺組織羥脯氨酸、IL-38及MIP-2mRNA含量的檢測。

1.2.3檢測方法 ELISA檢測大鼠肺組織羥脯氨酸含量及肺組織中IL-38的表達情況，嚴格按照大鼠酶聯免疫吸附劑測定試劑盒說明書步驟。

RT-PCR法測定肺纖維化大鼠肺組織中MIP-2mRNA表達：嚴格按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用熒光定量RT-PCR，嚴格按照試劑盒說明進行PCR反應。GAPDH為內參。MIP-2、GAPDH引物由大連寶生物技術有限公司合成及驗證。如下：MIP-2(191 bp):F:5′-TCATGAAGTTTGTCTCAACCCTG-AA-3′;R:5′-AGACAGCGAGGCACATCAGGTA-3′。GAPDH(307 bp):F:5′-CGGAGTCAACGGATTTG-GTCGTAT-3′;R:5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGA-AGAC-3′。用ABI Prism 7300 SDS Software測定光密度值CT，通過2-ΔΔCT計算MIP-2 mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1大鼠的生理狀態及肺組織肉眼觀 N組大鼠口唇淡紅色，活動靈敏，飲食及睡眠可，呼吸頻率正常，體毛色澤佳，體重遞增，大鼠肺組織外觀表面光滑，為淡紅色，質軟，邊緣銳利；B組大鼠口唇發紺，日漸萎靡，活動遲鈍，飲食及睡眠差，呼吸頻率增快，呼吸困難日漸加重，活動后更甚，有明顯的缺氧癥狀，體毛色澤暗淡，在注射博來霉素14 d左右出現體毛脫落，體重逐漸減輕，早期取出大鼠肺組織有充血及出血，質硬，邊緣較鈍，28 d時出現大面積的體毛脫落，大鼠肺組織見散在分布的類似結節樣病灶，質硬，邊緣鈍；D組表現介于N、B組之間，且D組大鼠生理狀態和肺組織外觀較B組表現好。

2.2PF大鼠肺組織病理形態學改變 為了了解地塞米松改善BLM誘導的肺纖維化的作用機制，用HE染色，光鏡下(×200)選取視野觀察：各期N組大鼠肺泡結構輪廓較好，肺泡間無炎性細胞浸潤。與N組比較，B組第14天時肺泡間炎性細胞較多，肺泡間隔略增寬，第28天肺泡間隔明顯增寬、大量炎性細胞浸潤和成纖維細胞增生，大量肺泡壁斷裂，肺泡腔融合，纖維化程度最重，呈現肺泡炎-肺纖維化的動態病理演變過程。與B組比較，D組第28天肺組織內炎性細胞較少、成纖維細胞增生較少、部分肺泡壁斷裂及肺泡腔融合，肺纖維化程度較輕。見圖1。

2.3IL-38蛋白的表達情況 博來霉素組7 d后大鼠肺組織中IL-38的表達明顯降低，第28天下降最明顯，與N組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，地塞米松組腹腔注射地塞米松后，大鼠肺組織中的IL-38較B組表達水平提高，但仍低于N組。與N組及單獨氣管內給博來霉素組對比，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖1 HE染色肺組織病理改變(×200)Fig.1 Pathological changes of lung tissue with HE staining(×200)Note: N.Normal lung tissue;B.Bleomycin group;D.Dexamethasone group.

表1 不同時間大鼠肺組織IL-38表達情況(ng/L)

Note：Compared with group N，1)P<0.05；compared with group B，2)P<0.05.

2.4HYP及MIP-2的表達情況 博來霉素組7 d后大鼠肺組織中的HYP及MIP-2的含量明顯增高，第28天達高峰，與N組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明氣管內注入博來霉素后，大鼠肺組織產生炎癥反應，進而發展為肺纖維化。D組腹腔注射地塞米松后，大鼠肺組織中的HYP及MIP-2較B組下降，與單獨氣管內給博來霉素對比，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2、3及圖2。

表2 不同時間大鼠肺組織HYP表達情況(μg/L)

Note：Compared with group N，1)P<0.05；compared with group B，2)P<0.05.

表3 不同時間大鼠肺組織MIP-2表達情況

Note：Compared with group N，1)P<0.05；compared with group B，2)P<0.05.

圖2 MIP-2溶解曲線Fig.2 MIP-2 dissolution curve

3 討論

PF以肺彌散功能下降為主，為一種不可逆的肺功能受損，最終導致呼吸衰竭，部分患者因長期的煙霧粉塵接觸史而發病，隨著環境污染的加重，PF的發病率逐年提高[5,6]。在PF早期，受損的肺組織刺激炎性細胞的產生，可導致肺組織中巨噬細胞、粒細胞和淋巴細胞等炎性細胞的浸潤[7]。

HYP表達量可以用來反映PF程度，是大鼠PF造模成功的標志[8]。模型組氣管內注射博來霉素后，第7天HYP的表達量明顯增加，第14天時HYP仍有較高的表達量，第28天時達高峰，與對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明博來霉素誘導大鼠PF造模成功，肺損傷程度逐漸增加。

MIP-2是肺泡巨噬細胞和氣道上皮細胞分泌的蛋白質產物，它的特異靶細胞為中性粒細胞，對其起重要的趨化和激活作用[9]。當氣道上皮受到吸煙、大氣污染、細菌和病毒感染等因素刺激或損害時，巨噬細胞、中性粒細胞等迅速合成并釋放多種細胞因子，包括TNF-α和MIP-2等[10]。部分動物實驗發現MIP-2在博來霉素致肺纖維化中的作用[11]。另外有研究發現IL-38可減少IL-17、IL-22和IL-8等前炎癥因子的產生，所以IL-38也可能作為一種抗炎細胞因子在炎癥性疾病中發揮作用[12]。

PF尚無有效控制進展及根治方案，仍為當今研究的熱點。近年來研究者主要通過三種途徑探討不同藥物對促纖維化細胞因子的抑制作用：TGF-β/Smads、NF-κB途徑及TNF-α途徑[6]。Wanwen等[13]研究表明NF-κB的激活與多種炎性細胞因子、黏附因子、趨化因子等的基因轉錄表達密切相關，在細胞炎癥反應及凋亡中起重要的調節作用。另有研究表明IL-38可抑制NF-κB的活性，而MIP-2的產生依賴于NF-κB的激活，NF-κB可調節MIP-2基因的轉錄[14-16]。

本實驗研究結果提示，單純博來霉素組大鼠肺組織中的IL-38表達明顯低于N組及D組，HYP及MIP-2明顯高于N組及D組，差異具有統計學意義(P<0.05)，表明IL-38、MIP-2的表達在肺纖維化的形成過程中占有重要地位。本實驗在博來霉素致PF模型中，腹腔內預防性地給予地塞米松，可使大鼠PF程度下降，提示地塞米松能夠抑制MIP-2的表達，降低炎性反應，與Haddad等[17]研究成果相一致。地塞米松組大鼠肺組織中IL-38表達量在同一時間點均高于生理鹽水組及博來霉素組，差異具有統計學意義(P<0.05)。據此推測地塞米松可通過上調IL-38及下調MIP-2改善大鼠PF，IL-38在大鼠PF中的作用可能和MIP-2有關，IL-38可能通過NF-κB通路抑制MIP-2的產生，但其具體作用機制仍待進一步考證。然而，有實驗研究表明IL-38不同于傳統意義上的抑制劑，在低濃度時發揮較強的抑制作用，隨著濃度的升高其抑制作用反而減弱[3]。猜測與實驗條件、實驗材料等的差異有關，其中具體的原因與機制還需進一步探究。

本實驗提示IL-38可能通過體內復雜傳導通路抑制MIP-2的表達，而在大鼠PF發病中發揮抗炎、抗纖維化作用。在將來，通過對IL-38和MIP-2更全面的認知，研究促進IL-38產生及抑制MIP-2生物活性的藥物，都可能是控制肺部感染的一個重要環節，可以為臨床醫生提供更多新的治療方法，給PF患者帶來新希望。