基于免培養的微生物群落多樣性研究方法概述

李冬娟

(皖北衛生職業學院，安徽 宿州 234000)

隨著科技的發展，對微生物的研究已經不局限于單一菌落，而是更注重對微生物群落結構的研究.傳統的培養方法，在研究微生物群落多樣性方面做出了很多貢獻，但也存在著不足之處.如培養周期長，耗時久；要達到無菌操作，其實驗準備工作繁瑣；培養時得設定一定的溫度、培養基的營養成分、pH值等，只能在某一特定的培養條件下培養，培養條件單一，難以全面的反映微生物群落的多樣性和微生物群落的結構組成.已有研究表明，可培養的微生物僅占自然界的1%[1-2].隨著分子生物學技術的發展應用，可以通過免培養的方法，分析樣品中微生物的核酸序列，從基因水平對微生物群落組成進行定量和定性分析，這樣可以更全面地分析微生物群落的組成、遺傳的多樣性及其與環境間的關系.本文就目前應用于微生物群落分析的免培養方法進行總結.

1 不基于微生物總基因組DNA的分析方法

不基于微生物總基因組DNA的分析方法主要是通過測定樣品中生物標記物的含量來反映微生物的組成.一般選取的生物標記物是微生物細胞的生化組成成分，其總量與相應生物量呈正相關.由于特定結構的生物標記物標志著特定類型的微生物，因此可以分析一些生物標記物的種類、數量和相對比例來估算樣品中微生物群落的組成.因為該方法分析的是樣品中所有的生物標記物，一些難以通過傳統培養方法培養的微生物都包含其中，所以相對于傳統的培養方法而言，其結果更全面.

20世紀80年代以來常用于研究微生物群落多樣性的生物標記物方法有：醌指紋法(Quinones Profiling)、脂肪酸譜圖法(PLFAs和WCFA-FAMEs).White和Findlay于20世紀70年代末，80年代初發展了磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA)譜圖分析技術，對樣品中的微生物群落組成進行定量分析.之后也有學者將該方法應用于土壤和受污染水體中微生物群落組成的研究中.

脂肪酸含量會因為生長期不同，環境不同而發生改變.因此可通過環境因素標準化來改善環境因素對結果的影響.美國的MIDI公司已經將PLFA技術商品化.常見的微生物PLFA譜圖，基本上都包括在其數據庫內，而且對于某些特定菌種，儀器要求也由GC-MS降為GC.PLFA方法的不足之處在于，一方面對微生物的分類還不夠精確，只能根據某些相同生理特征分成一個大的類群；另一方面， PLFA方法不能用來分析生態系統中單個菌株或種水平上的微生物，因為尚未確立所有微生物的特征性磷脂脂肪酸.因此，在分析微生物群落時通常將該方法和其他方法結合在一起使用.

2 基于微生物總基因組DNA的分析方法方法

2.1 熒光原位雜交(Fluorescence Insitu Hybridization，FISH)

FISH結合了顯微鏡的可視性和分子生物學的精確性.該方法是以標記的細菌核糖體具體的某個區域為探針，然后用熒光顯微鏡和流式細胞儀來觀察結果.一般整個過程只需幾個小時.FISH技術可以揭示研究對象的形態學特征，檢測環境中的微生物量，以及微生物之間的相互作用[3].FISH已經廣泛的用于環境和食品微生物學中，如檢測并鑒定葡萄酒里面的乳酸菌，分析奶酪表面的菌群[4]，研究發酵食品里面的益生菌雙歧桿菌以及海洋食品中短乳桿菌等.FISH技術也存在著一些不足，如自動化程度低、難以應付高通量樣品；根據樣品特點需要事先設計足夠的探針以備試驗所需，雜交率低等問題.目前該技術有了新的發展，如催化報告沉積熒光原位雜交技術 (Catalyzed reporter deposition-FISH，CARD-FISH)，有學者已經將該項技術應用于土壤、海洋和底泥等環境中微生物群落結構的研究中[5].

2.2 變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳(PCR-Denaturant Gradient Gel Electrophoresi and PCR-Temperature Gradient Gel Electrophoresis，PCR-D/TGGE)

該方法是根據核酸堿基序列中GC堿基對的含量影響Tm值的原理設計的.自1995年Muzyer等首次將該方法用于微生物群落多樣性的研究以來，目前該方法已被應用到分析受污染土壤、水體、原油、食品如礦泉水、牛肉、乳制品、葡萄酒、奶酪、泡菜發酵玉米粉等的微生物群落組成情況.

用DGGE法研究微生物群落時，一般只能檢測到環境中的優勢菌群.如：只能分離較小的片段(500bp以內)，提供信的息量有限.燕平梅、蔡宏宇等分別采用PCR- DGGE技術分析泡菜、棗陽酸漿水中的優勢菌群[6-7].DGGE分析法在實驗條件不適宜時，有可能會出現條帶共遷移現象，因此會低估樣品中微生物群落的多樣性.

2.3 PCR-單鏈構象多態性(single strand conformational polymorphism，PCR-SSCP)

臨床上最初將該方法用于鑒定基因突變，近年來逐漸被應用于微生物群落多樣性的研究中.該方法的原理是，不同構象的DNA分子在聚丙烯酞胺凝膠中受到的排阻不同，DNA分子中堿基配對等形成的作用力可以維持DNA單鏈片段的空間構象.當堿基發生改變時，其空間構象也會隨之發生改變.因此，可以通過非變性聚丙烯酞胺凝膠電泳(PAGE)，將構象上有差異的分子分離開.

SSCP與DGGE的共同點是它可以將長度相同序列不同的DNA碎片區分開.與DGGE不同的是，SSCP是依靠不同序列的DNA單鏈分子形成不同空間構象而將其區分開.然而，因為不需要GC夾做引物，這一點SSCP的PCR產物比DGGE更有說服力.SSCP主要的缺陷是，SSCP是同一個單鏈DNA碎片形成的許多穩定的結構，這樣會在凝膠上出現多個復雜的條帶.此外，也有研究表明，在電泳時出現DNA重退火的比率較高，尤其是在分析微生物群落組成比較復雜的樣品時.SSCP曾被用于不同的環境中，包括水體土壤和厭氧消化灌中的微生物組成情況等，可是近幾年該方法并不常用于微生物群落多樣性的研究.

2.4 擴增核糖體DNA限制性分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis ARDRA)

ARDRA 是用PCR擴增經限制酶在特殊位點酶切的16SrRNA片段，然后經電泳將其分離的一種方法.不同的DNA序列會有不同的酶切位點，代表不同群落的序列會出現特殊的泳帶.由于該方法簡便、快速、廉價已被用于微生物的鑒定和微生物群落多樣性的研究中.Fries等人將三氯乙烯作為生物刺激因子，通過用ARDRA方法分析地下水的優勢菌群組成及分布情況來確定地下水受苯酚，甲苯和含氯脂肪族化合物的污染情況.Gich 用ARDRA方法分析了工廠污水處理系統里面的活性污泥中微生物群落組成情況，Hohnstock用ARDRA方法分析了受三氯乙烯污染的水體里面的菌群變化情況.Acinas 等曾用這種方法研究了海洋浮游生物隨時空變化的情況[8].

在使用該方法時凝膠的著色敏感性較低，這樣非優勢菌的條帶就會丟失，從而丟失系統發育信息.該方法還需要優化限制酶，尤其當序列是未知的情況下，選擇合適的限制酶比較困難.因此該技術只能用于研究那些微生物群落較單一的樣品中，在闡明具體的系統發育和估算復雜的微生物群落組成時還受到限制，在最近的一些研究中通常將ARDRA和其他的一些方法結合在一起.

2.5 末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)

該方法的原理是用特異性限制性內切酶消化經熒光染料標記的PCR產物，然后將消化產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細管電泳分離，最后用熒光檢測儀檢測標記片段的大小、種類和數量，并用GeneScan軟件對結果進行分析.該方法的優點是可以更直觀并定量的分析PCR產物.在T-RFLP分析中使用自動檢測系統和毛細管電泳，可以提高樣品通量，而且在微生物群落分析中結果比其他方法更精確.自Brodie 報道該方法在研究真菌時比DGGE更靈敏后，該方法已被越來越多的應用于微生物群落多樣性的分析中.

該技術的不足之處是，T-RFLP仍舊依賴于PCR，而PCR的結果又直接受DNA提取以及擴增引物的影響.使用不同的酶就會造成不同的群落圖譜，如果酶解不徹底會造成結果偏高，因此，用該種方法分析微生物群落時，應該至少需要兩到四種限制性酶以免結果誤差較大.但除了這些不足之處，該技術在研究微生物群落多樣性方面有著非常高的應用價值.尤其在研究高通量樣品時，不需要檢測核算序列，并且靈敏度很高.該方法已經被廣泛的應用于食品工業等微生物群落組成比較復雜的樣品中，如養魚場、奶酪加工廠等.

2.6 核糖體間隔分析(Ribosomal intergenic spacer analysis RISA)

RISA是以PCR擴增16SrRNA與23S rRNA之間的間隔區為基礎來鑒別微生物種類的一項技術.因為不同種屬的間隔區在序列和長度(一般長度在50-1500bp)上都是可變的，經過電泳后，會產生不同的條帶，每一個條帶至少代表一種微生物.RISA現在也被用于研究微生物群落的多樣性.在環境方面，RISA曾被用來檢測土壤中可以在低溫條件下降解PAH的厭氧的硝酸鹽還原菌以及檢測淡水中微生物多樣性及群落組成情況[9]，也有報道將該方法用于分析食品中的微生物群落多樣性.

RISA是一種非常快速簡單的方法，但是分析受污染地區的不可培養微生物或者未知的微生物群落組成時該方法就顯得不是那么的有效，主要是因為核糖體間隔區序列數據庫比較有限.另外，RISA存在的潛在問題是優先擴增較短的模板.在環境應用中，RISA有著較高的序列可變性，一種細菌可能會出現不只一個條帶，從而使結果更復雜，高估樣品中微生物的多樣性.

2.7 高通量測序技術

高通量測序技術被稱之為第二代測序技術，可以同時對幾百萬條DNA分子進行測序.目前在微生物群落分析中應用比較多的是Illumina MiSeq 高通量測序技術.該方法已被應用于土壤、對蝦、牛瘤胃、客氣等微生物群落的分析中[10-12].該方法不僅可以研究樣品中微生物的豐度、分布，還可以研究微生物物種豐度的差異，在研究樣品中優勢菌群時與DGGE有著一致的結論[13]，目前該方法已經成為研究微生物群落組成時最主要的方法.

3 結束語

以上綜述了在研究微生物群落多樣性時應用比較廣泛的技術，目前還有一些方法如變性高效液相色譜法(DNPLC)和DNA微矩陣等也用于研究微生物群落.免培養方法雖然快速簡便，但也存在一定的局限性，如不容易獲取環境樣品中所有微生物的 DNA、難以精確地確定微生物的分類地位等， 仍有一些菌只能通過培養方法才能檢測得到.傳統培養分離方法在微生物群落的研究中也是不可或缺的，在微生物種群分類上，可以依靠傳統的培養方法做出形態學和生化功能的鑒定.目前的每一種分析方法都有自身的優勢和局限性，也都在發展和完善當中，并且各種技術之間也是相互補充相互促進的.

根據以上應用比較廣泛的技術看，主要問題還是集中在全面的分析未知樣品中微生物群落的多樣性，微生物群落的變異也難以測量，輔助試劑對觀測體的損害程度也難以準確評估.各技術的相互補充也并沒有完全結合上，這也給微生物的研究提出了要求，隨著現代科技的進步，高級顯微鏡及計算機的應用也將為微生物的研究提供強大的技術支持，這也為免培養方法的應用與完善開拓了空間，利用現代科技工具不斷完善已有技術的局限點，將會在微生物群落檢測方面得到突破.