疏血通注射液對(duì)兔耳增生性瘢痕MMP-2和ɑ-SMA表達(dá)的影響

施建飛 陳曉棟

增生性瘢痕(HS)是以成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖為特征的皮膚纖維增殖性疾病,其特征是由成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積[1]和基于膠原，如膠原蛋白I和膠原蛋白III的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的代謝紊亂[2]。最常繼發(fā)于燒傷后，是消防員燒傷康復(fù)的主要后遺癥。增生性瘢痕不僅導(dǎo)致外觀變化還影響器官和組織功能，給患者生理和心理帶來(lái)極大痛苦，目前治療的手段多是在瘢痕形成后才開始干預(yù)，防治策略多為抑制成纖維細(xì)胞增殖、促其凋亡、調(diào)節(jié)膠原代謝，治療方法多樣[3]，然而效果不甚理想。

在瘢痕組織中，成纖維細(xì)胞發(fā)揮重要作用，因此，防治瘢痕形成與發(fā)展的重點(diǎn)是抑制成纖維細(xì)胞的生物學(xué)活性。臨床實(shí)踐中，糖皮質(zhì)激素，如曲安奈德、復(fù)方倍他米松注射液等單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物，如5-FU等進(jìn)行瘢痕內(nèi)注射，是治療增生性瘢痕的常用方法之一[4]。但是這些藥物本身的毒副作用及療效不確定，使之具有局限性。從中藥和天然藥提取物中篩選抗皮膚瘢痕的功效藥物，該方向有較大的研究?jī)r(jià)值。

疏血通的主要成分水蛭、地龍，抗凝、溶栓，對(duì)血小板聚集有一定抑制作用、對(duì)血液流變學(xué)的改變有作用。靜脈滴注疏血通，抑制抗血小板的聚集，改善微循環(huán),提高創(chuàng)面肌層組織血流的供應(yīng),改善局部細(xì)胞的代謝,增加營(yíng)養(yǎng)，從而有利于組織的早期修復(fù)[5]。疏血通局部注射用于增生性瘢痕的治療未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以兔耳增生性瘢痕模型[6]為研究對(duì)象，局部注射疏血通，觀察并研究它對(duì)增生性瘢痕組織作用的影響，為藥物的臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇新西蘭白兔9只，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心供應(yīng)。雌性5只，雄性4只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，兔耳完整健康，分籠進(jìn)行喂養(yǎng).按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組3只，所有動(dòng)物一般資料無(wú)顯著性差異。所有實(shí)驗(yàn)按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)指南進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 參照李薈元等[6]模式建立兔耳增生性瘢痕模型，用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)作耳緣靜脈麻醉，皮膚消毒，沿長(zhǎng)軸避開可見(jiàn)血管，利用角膜環(huán)鉆作直徑1cm圓形創(chuàng)面，創(chuàng)面距離1cm以上，去掉兔耳全層皮膚并用刮勺完全刮除軟骨膜，創(chuàng)緣徹底止血，每耳6處，共108個(gè)創(chuàng)面，術(shù)后創(chuàng)面暴露，待其自行愈合。

1.2.2 藥物注射 建模后30 d,待創(chuàng)面上皮化后,將其隨機(jī)分為3組，空白對(duì)照組，曲安奈德組，疏血通組，每組3只。疏血通組和曲安奈德組分別注射疏血通注射液和曲安奈德注射液，空白對(duì)照組注射等劑量生理鹽水。注藥方式參照文獻(xiàn)[7]：用微量注射器從創(chuàng)面四周的正常皮膚進(jìn)針向創(chuàng)面基底部及創(chuàng)面灶內(nèi)局部注射，注藥量為50 μL/創(chuàng)面，3天給藥1次，共6次。

1.2.3 瘢痕增生指數(shù)測(cè)量 給藥后20 d，在無(wú)菌條件下取材，用螺旋測(cè)微儀測(cè)算瘢痕厚度及瘢痕四周正常皮膚厚度[8]，瘢痕增生指數(shù)=瘢痕厚度/正常皮膚厚度，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 HE染色 作HE染色時(shí)，取出切片在37℃孵育箱中進(jìn)行回溫，將回溫好的切片，水中浸泡30～60 s左右。染色前用蒸餾水潤(rùn)濕組織1～2 min，核染液染色5 min左右，水洗3～5 s，分色劑中蘸2下，水沖。槳染液染色2 min，按照梯度脫水，吸干，封片鏡檢。

1.2.5 VG染色 VG天青石藍(lán)染色液滴染2～3 min，稍水洗， Mayer蘇木素染色液滴染2～3 min。稍水洗，酸性乙醇分化液分化1～2 s。流水沖洗10 min。用配制好的改良VG染液滴染1～2 min。急速用水洗一下，即用95%乙醇快速分化脫水,無(wú)水乙醇脫水3次，每次5～10 s。二甲苯透明3次，每次1～2 min,中性樹膠封片鏡檢。

1.2.6 qRT-PCR 引物序列:GAPDH上游5’-CGATGGTGAAGGTCGGAGTG-3’，下游5’-ACATGTAGACCATGTAGTGGAGG -3’；MMP2 上游5’-CACTGGTGTTGGGGGAGATT-3’，下游5’-CACGGACCACTTGACCTTCT -3’；ɑ-SMA 上游5’-TGTCAGGAATCCCGTGAAGC-3’，下游5’-CATTGTCACACACAAGGGCG-3’；按試劑盒說(shuō)明,在反應(yīng)管中依次加入試劑。GAPDH作為內(nèi)參 .采用2-△△CT的方法分析增生性瘢痕組織中 mRNA水平。

1.2.7 Western Blot 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)所述[9]，組織稱重，加入裂解液，充分勻漿，離心后，取上清,測(cè)定蛋白濃度。凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h, 顯影。GAPDH作為內(nèi)參。采用Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕厚度及瘢痕增生指數(shù) 兔耳增生性瘢痕模型建立，待創(chuàng)面上皮化，給藥后20 d，在無(wú)菌條件下取材，測(cè)量瘢痕厚度及瘢痕四周正常皮膚厚度，并計(jì)算瘢痕增生指數(shù)，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，曲安奈德組和疏血通組瘢痕厚度明顯降低，瘢痕增生指數(shù)降低。 曲安奈德組和疏血通組兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 HE染色 我們采取HE染色的方法驗(yàn)證增生性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞表達(dá)情況，結(jié)果顯示：空白對(duì)照組中有較多的成纖維細(xì)胞，而曲安奈德組與疏血通組成纖維細(xì)胞相對(duì)較少(圖1)。

2.3 VG染色 我們采取VG染色的方法進(jìn)一步驗(yàn)證增生性瘢痕組織中膠原纖維表達(dá)情況，結(jié)果顯示：空白對(duì)照組膠原纖維排列相對(duì)較為密集，曲安奈德組與疏血通組成膠原纖維排列相對(duì)較為稀疏(圖2)。

表1 各組瘢痕厚度及瘢痕增生指數(shù)比較

注：與空白對(duì)照組相比，曲安奈德組和疏血通組瘢痕厚度明顯降低***P<0.001，與空白對(duì)照組相比，曲安奈德組和疏血通組瘢痕增生指數(shù)降低**P<0.01

2.4 qRT-PCR檢測(cè)增生性瘢痕組織中MMP-2和 ɑ-SMA的mRNA水平的變化 我們采取qRT-PCR的方法檢測(cè)增生性瘢痕組織中MMP-2和 ɑ-SMA mRNA水平表達(dá)變化，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，曲安奈德組和疏血通組MMP-2 mRNA表達(dá)顯著降低(***P<0.001)，ɑ-SMA mRNA表達(dá)降低(**P<0.01)。曲安奈德組和疏血通組兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2、圖3)。

2.5 Western blot檢測(cè)瘢痕組織中MMP-2和ɑ-SMA表達(dá)相對(duì)灰度值和蛋白表達(dá)變化 我們采取Western blot方法檢測(cè)增生性瘢痕組織中MMP-2和 ɑ-SMA 蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，曲安奈德組和疏血通組MMP-2和ɑ-SMA蛋白表達(dá)降低(**P<0.01，*P<0.05)。曲安奈德組和疏血通組兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3、圖4)。

表2 2-△△CT方法分析增生性瘢痕組織中mRNA水平

注： 與空白對(duì)照組相比，***P<0.001，**P<0.01

表3 Image J分析增生性瘢痕組織中蛋白表達(dá)相對(duì)灰度值

注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01，*P<0.05

1a、1b、1c分別為空白對(duì)照組，曲安奈德組，疏血通組，空白對(duì)照組中有較多的成纖維細(xì)胞，而曲安奈德組與疏血通組成纖維細(xì)胞相對(duì)較少

圖1 給藥20 d各組兔耳瘢痕HE染色結(jié)果(×400)

2a，2b，2c分別為空白對(duì)照組，曲安奈德組，疏血通組，可見(jiàn)空白對(duì)照組膠原纖維排列相對(duì)較為密集，曲安奈德組與疏血通組成膠原纖維排列相對(duì)較為稀疏，(膠原纖維為鮮紅色，肌纖維、胞質(zhì)及紅細(xì)胞為黃色，細(xì)胞核為藍(lán)褐色)

圖2 給藥 20 d 各組兔耳瘢痕VG染色結(jié)果(×400)

圖3 增生性瘢痕組織中MMP-2和 ɑ-SMA mRNA水平 3a：MMP-2 mRNA水平 與空白對(duì)照組比較***P<0.001，3b：ɑ-SMA mRNA水平 與空白對(duì)照組比較，**P<0.01圖4 增生性瘢痕組織中MMP-2和 ɑ-SMA蛋白表達(dá)變化 與空白對(duì)照組相比，**P<0.01；*P<0.05

3 討論

Retz在1789年描述了皮膚瘢痕，它們的組織學(xué)外觀是由于成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，真皮層細(xì)胞凋亡受到抑制后的皮膚受損[10]。HS有時(shí)會(huì)產(chǎn)生瘢痕攣縮，特別是對(duì)于關(guān)節(jié)的瘢痕攣縮，會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙。有許多治療增生性瘢痕的方法包括糖皮質(zhì)激素瘢痕組織內(nèi)注射、壓力療法、硅膠產(chǎn)品外用、手術(shù)切除、激光和冷凍治療等。其中，曲安奈德或復(fù)方倍他米松注射液通過(guò)局部注射治療增生性瘢痕[11]，藥物的效果比較明顯，但反復(fù)多次局部注射對(duì)機(jī)體影響較大，如:注射時(shí)疼痛劇烈;停藥后局部發(fā)紅、水腫、灼熱、瘙癢、干燥、脫屑等[12]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，曲安奈德對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)分化能力和膠原的產(chǎn)生有一定的抑制作用[13]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[14]MMP2的活性在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中顯著增加,當(dāng)MMP2升高時(shí)促進(jìn)瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞中的遷移活動(dòng)。ɑ-SMA一直被認(rèn)為是區(qū)別成纖維細(xì)胞與轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞的可靠標(biāo)記，以及組織纖維化水平[15]。在瘢痕形成的病理過(guò)程中，成纖維細(xì)胞被激活分化成肌成纖維細(xì)胞表達(dá)過(guò)多的a-SMA，并產(chǎn)生大量的ECM如膠原蛋白I和膠原蛋白III[16].a-SMA是一種在血管平滑肌和肌成纖維細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)，是增生性瘢痕的特征性標(biāo)志并通過(guò)肌成纖維細(xì)胞收縮對(duì)發(fā)病機(jī)制有顯著意義[17]。

血管生成對(duì)傷口愈合和組織再生是必不可少的，特別是在愈合的增殖階段。在傷口愈合過(guò)程的早期階段，觀察到穩(wěn)健的新血管形成。人們普遍認(rèn)為，炎癥和傷口愈合延遲與瘢痕形成有關(guān)。盡管血管生成對(duì)傷口愈合至關(guān)重要，但許多研究表明過(guò)度的血管生成反應(yīng)導(dǎo)致瘢痕形成[18]。微血管形成在增生性瘢痕中比在正常營(yíng)養(yǎng)性瘢痕中更劇烈。疏血通的主要成分是水蛭與地龍，水蛭對(duì)凝血酶的產(chǎn)生有一定的抑制作用,是一種功能比較強(qiáng)的凝血酶抑制劑,對(duì)微循環(huán)的改善和抗凝血功能有明顯的作用[19]。靜脈滴注疏血通具有對(duì)抗血小板的聚集和改善微循環(huán)的作用, 提高創(chuàng)面肌層組織血流的供應(yīng)改善局部細(xì)胞的代謝,增加營(yíng)養(yǎng),祛腐生肌,從而有利于組織的早期修復(fù)[5]。

本實(shí)驗(yàn)觀察治療后兔耳增生性瘢痕的外觀形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)，疏血通組瘢痕的顏色有相對(duì)變淺的趨勢(shì)，厚度也稍有降低。對(duì)成纖維細(xì)胞和膠原纖維的表達(dá)有一定的抑制作用，疏血通局部注射后能降低瘢痕組織內(nèi)ɑ-SMA和MMP-2的表達(dá)，一定程度上抑制瘢痕的形成。

疏血通注射液可能通過(guò)降低MMP2和ɑ-SMA的表達(dá)，對(duì)增生性瘢痕有一定的抑制效果，這為疏血通局部注射治療增生性瘢痕的臨床應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。