α-硫辛酸對UVB誘導的角質形成細胞氧化應激的影響

黃 丹 鞠 梅 陳 崑 吳敏智 顧 恒

近年來研究發現，外源因素誘導的氧化應激在致皮膚毒性過程中起著關鍵作用，導致多種皮膚疾病的發生，比如衰老、皮膚腫瘤、免疫性皮膚病等[1]。LA是類似于維生素B族的一種抗氧化劑，存在于線粒體，具有脂溶性和水溶性，外界補充的LA可到達細胞的任何一個部位，有極強的抗炎以及自由基清除能力，有較好的應用前景[2]。近年來已經廣泛應用于糖代謝、糖尿病及其并發癥、心腦血管和其他多種疾病，但在皮膚科疾病中應用較少，為了解該抗氧化劑能否對人皮膚光損傷產生保護作用而設計了該研究。本研究用UVB制造氧化應激模型，探討LA對紫外線誘導的角質形成細胞氧化應激狀態的影響。本研究采用過氧化氫來誘導氧化應激反應[3,4]，建立人皮膚細胞的氧化應激陽性對照。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑 細胞標本：原代角質形成細胞取自健康成人包皮環切術后的包皮。主要試劑：單丹(磺)酰戊二胺(Monodansylcadaverine, MDC)、MTT、LA、3%過氧化氫溶液、DCFH-DA熒光探針(美國Sigma-Aldrich公司)。胎牛血清(Gibico公司，烏拉圭)，角質形成細胞無血清培養基(KSFM，美國Gibco公司)，MDA、TAOC試劑盒(南京建成生物工程研究所)，RPMI裂解液(碧云天生物公司)。其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器設備 UVB輻照儀(上海希格瑪高技術有限公司)，UVB熒光燈管(UVB Broadband PL-S 9W/12，美國飛利浦公司)，全波長酶標儀(美國Thermo公司)，流式細胞儀(BD FACSVerseTM Flow Cytometer，美國Bio-Rad公司)，微量高速冷凍離心機(5810R，德國Eppendorf公司)，超聲細胞破碎儀(Vcx-130，美國Soics公司)，PK-SB型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 原代KC培養于KSFM培養基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中孵育。取第3～8代對數生長期細胞按(5～8)×104/mL密度接種到相應的培養皿。

1.2.2 實驗分組及處理 預實驗中UVB照射分5、10、20、40和80 mJ/cm25個劑量梯度，H2O2分為0、0.5、1.0和10.0 mmol/L四個濃度梯度，根據細胞狀態及生長活力，選取UVB 40 mJ/cm2作為照射組，H2O210.0 mmol/L作為陽性對照組，以及陰性對照組，共三個組別。照射組又分為兩個亞組：一組在照射結束后加入正常培養基，一組加入含LA終濃度0.5 mmol/L的培養基孵育，分別在4 h、12 h收集細胞進行相應檢測。陽性對照組H2O2孵育4 h、12 h后進行相應檢測。

1.2.3 制作UVB光損傷細胞模型 細胞接種在6孔板上，每孔1.5 mL細胞懸液，搖晃均勻，置于5% CO2孵箱37℃下孵育，約12 h后細胞貼壁，待細胞增殖鋪滿80%～90%培養皿底時進行UVB照射處理。照射前用槍頭吸去上清，預熱的PBS緩沖液沖洗一遍，每孔加入適量PBS，使薄層液體覆蓋細胞。使用本課題組定制的UVB細胞照射裝置，光源選用平行布置的9支飛利浦寬波UVB熒光燈管(Philips UVB Broadband PL-S 9W/12)。照射前打開光源預熱10 min，使輸出光源能量穩定，經UVB輻照儀測量校訂，選取輻照強度相對最為均衡的照射平面(距熒光燈管16 cm處)，平均輻照強度通常在1.50 mW/cm2左右。根據需要的照射量計算出照射時間，設置時間，開始照光，照射結束后吸去PBS。照射時周圍的孔用遮光紙完全遮蓋。陰性對照孔除不照光，其他處理同照射組。

1.2.4 H2O2制作陽性對照：細胞鋪滿培養皿底80%～90%時加入含10 mmol/L H2O2的培養基，分別在重新孵育后4、12 h終止孵育，PBS清洗兩遍，進行下一步處理。

1.2.5 LA干預 LA干粉加入無水乙醇配成0.5 mol/L的母液，分裝4℃保存，使用時按照1∶1000直接用培養基稀釋成終濃度500 μmol/L的試驗用終濃度。

1.2.6 2’7’-二氯熒光乙酰乙酸鈉(DCFH-DA)染色測定活性氧自由基(ROS) 去除培養基，加入稀釋好的DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μmmol/L，37℃孵箱里孵育30 min，用無血清培養基洗滌細胞3次，用胰酶將細胞消化下來。DCFH被細胞內的ROS氧化成高熒光強度的DCF(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein)，流式細胞儀檢測該熒光強度，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強度的變化，并用流式細胞術對綠色熒光進行定量。

1.2.7 化學法檢測細胞內脂質過氧化物MDA和TAOC 預冷PBS洗滌細胞兩次，RPMI裂解液于冰上裂解細胞，10000 rpm離心10 min，取上清液，-20℃保存待測，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.8 數據分析

1.2.8.1 觀察指標 倒置熒光顯微鏡下動態觀察各組細胞形態以及DCFH-DA染色后熒光強度變化，并用配套的成像拍照設備拍攝圖片。綠色熒光定量、MDA和TAOC濃度均以計量資料體現。

2 結果

2.1 UVB照射后角質形成細胞形態變化

2.1.1 UVB照射 原代角質形成細胞經照射后，較陰性對照組細胞，漂浮死亡的細胞逐漸增多，貼壁的細胞部分失去正常的膜結構，折光度變差。總體上照射后12 h的細胞形態較4 h有所恢復。見圖1a～1c。

2.1.2 H2O2孵育 經10 mmol/L H2O2作用4 h后細胞間隙增寬、死亡的細胞增多，作用到12 h細胞密度又恢復正常，但細胞輪廓欠清，有較多漂浮死亡的細胞。見圖1d～1f。

2.2 DCF-DA染色法及流式細胞術檢測ROS產生水平 40 mJ/cm2UVB照射后4 h細胞綠色熒光強度較對照組增強，提示ROS產生增多，照射后即刻加LA孵育4 h后肉眼見熒光強度有所減弱，但仍較對照組強。見圖2。流式細胞術檢測綠色熒光強度，照射后4 h，細胞的熒光強度與H2O2陽性對照相當[(35311±3072.3) vs. (37075±2049.8)]，均較陰性對照組明顯升高(24465±2085.3,P<0.001)，加LA干預后熒光強度下降至接近陰性對照組水平(26926±3502.7,P>0.05)，提示ROS產生減少。

從圖3看出，UVB照射后12 h，即使未使用LA干預，熒光強度較照射后4 h也有較顯著的下降(P=0.006)，加抗氧化劑LA孵育后熒光值較未加抗氧化劑差別仍有統計學意義[(28253.33±2288.0)vs. (24500±2203.20),P=0.002]。單因素方差分析顯示除陽性對照組與陰性對照組有顯著差異外(P<0.001)，其余組與陰性對照組均無顯著性差異。見表1。

2.3 MDA檢測結果 各組及各時間點MDA的趨勢與ROS的變化趨勢相當， 40 mJ/cm2UVB照射后4 h，與陰性對照組之間差別有顯著性差別[(11.61±0.68) vs (8.25±1.21) nmoL/mg·prot，P=0.004 )]，照射后12 h，MDA有所下降[(9.95±1.17)nmoL/mg·prot]，但仍較陰性對照組高；無論是照射后4 h還是12 h，經過LA干預后MDA值均得到下降，以40 mJ照射后LA孵育4 h后MDA下降更為明顯(P=0.019)。見圖4，表1。

2.4 TAOC檢測結果 根據標準曲線和測得的A值計算出各組TAOC濃度，單因素方差分析，F=0.518，LSD檢驗兩兩比較均P>0.05，各組之間均無統計學差異。見表1，圖5。提示各組總抗氧化能力無顯著差異。

MDA單因素方差分析F=4.695，對照組和H2O2之間、對照組和40 mJ/cm2UVB照射后4 h之間差異有顯著統計學意義(P<0.05)，40 mJ/cm2UVB照射后4 h與12 h之間P=0.031，照射后4 h、12 h后加LA與未加LA 孵育兩組間均有顯著統計學意義(P<0.05)，其余各組兩兩之間均顯著無統計意義。TAOC統計分析各組之間均無顯著統計學意義(P>0.05)。

圖1 UVB照射或者H2O2孵育后細胞的形態變化 a：原代角質形成細胞；b,c:40 mJ/cm2UVB照射原代角質形成細胞后4、12 h后部分貼壁的細胞部分失去正常的膜結構，折光度變差；d：原代角質形成細胞；e,f:10 mmol/L H2O2溶液作用4 h后細胞間隙增寬、死亡的細胞增多，作用到12 h細胞密度又恢復正常，但細胞輪廓欠清，有較多漂浮死亡的細胞

圖2 DCF-DA染色效果圖 a、b、c圖依次為對照組、UVB照射組、UVB照射+LA治療組，可見后兩組綠色熒光強度較對照組明顯增強，提示ROS產生增多，c組熒光較b組有所減弱

圖3 UVB照射后4、12 h原代角質形成細胞DCFH-DA染色顯示ROS熒光強度的對比圖4 UVB照射后4、12 h，LA孵育4、12 h原代角質形成細胞MDA濃度對比圖5 UVB照射后4、12 h，LA孵育4、12 h原代角質形成細胞總抗氧化能力，各組之間均無統計學差異

表1 原代角質形成細胞DCFH-DA染色后DCF熒光強度、化學法檢測MDA和TAOC濃度

注：n=3。流式細胞儀檢測原代角質形成細胞DCFH-DA染色后DCF熒光強度，單因素方差分析，F=13.352，陽性對照組、照射后4 h組ROS強度與陰性對照組均有顯著差異(P<0.001)，照射后12 h組較4 h組ROS下降有顯著差異(P=0.006)；照射后加抗氧化劑LA孵育4 h ROS下降較未加抗氧化劑組有統計學意義(P=0.002)

3 討論

正常的皮膚細胞由于新陳代謝產生少量的O2-、H2O2，UVA和UVB照射后通過直接作用和間接作用產生大量的ROS，包括超氧陰離子、單線態氧、過氧化氫和羥自由基。細胞內存在固有的抗氧化防御系統，有清除ROS的作用，包括超氧化歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽過氧化物酶等酶類；以及谷胱甘肽(GSH)、尿酸、輔酶Q和泛醌等活性物質[3]。如果ROS不能被抗氧化系統及時拮抗，則會通過循環系統至其他組織和細胞發生脂質過氧化，從而誘導DNA-蛋白質交聯物和嘧啶二聚體等的產生，引起ERK1/2、p38 MAPK、JNK和NF-kappaB等信號通路的異常激活[5]，這些異常激活的信號通路將造成對組織分化增殖和損傷炎癥過程的異常調控，參與UVB介導的凋亡、光誘導腫瘤、光敏感性皮膚病和光老化的發生。要降低自由基對人體的危害，除了依靠體內自由基清除系統外還要尋找和發掘外源性自由基清除劑。

臨床常用的抗氧化劑如維生素C為水溶性，抑制細胞釋放氧自由基，清除細胞周圍氧自由基、提高過氧化氫酶谷胱甘肽還原酶活性，主要在生物水溶性腔隙中發揮較強的抗氧化作用；維生素E為脂溶性，主要保護細胞膜受到脂質過氧化損傷，需要在其他抗氧化劑如維生素C的協同下再循環利用[2]。而LA同時具有脂溶性和水溶性，是線粒體a-酮酸氧化脫氫酶的一個輔助因子，LA能夠還原內源性抗氧化劑如維生素C、維生素E和谷胱甘肽，螯合鐵、銅和其他金屬，與這些金屬離子穩定結合，抑制這些金屬催化的脂質過氧化。LA的還原態二硫辛酸(DHLA)通過清除體內的氧自由基和動員機體內源性的抗氧化劑如維生素C、維生素E和谷胱甘肽的生成發揮抗氧化作用[6,7]，作為新一代的抗氧化劑LA和DHLA一起被譽為“萬能抗氧化劑”，有廣泛的應用前景。近年來有數個小規模的臨床研究報道局部外用5%的LA制劑有效改善面部的光老化現象，包括皮膚粗糙、細紋、暗沉，并抑制UV導致的皮膚曬傷，減少角質形成細胞凋亡[8,9]。但在皮膚角質形成細胞LA抗氧化應激的的機理研究仍非常少。

本研究設置了外源性H2O2孵育組作為陽性對照組，運用UVB照射誘導角質形成細胞產生氧化應激壓力，從氧化損傷水平和抗氧化水平檢測了細胞內氧化-抗氧化體系，結果證實40 mJ/cm2UVB能誘導氧化應激反應的發生，相當于10 mmol/L H2O2的氧化效果。流式細胞儀技術將染色后激發的綠色熒光準確定量，表明40 mJ/cm2的UVB照射后4 h細胞內的ROS 水平較陰性對照組升高約30%～40%，與既往研究結果相一致[10]，隨著時間的推移ROS有自行下降的趨勢。照射后經過抗氧化劑LA的處理，ROS下降的更為迅速。(見圖2和表1)。MDA是細胞膜脂質被活性氧氧化的產物，是評價氧化應激損傷程度的重要標志物，過度累計可直接反應受氧化應激損傷的程度。本研究結果顯示MDA的變化趨勢與ROS一致，抗氧化劑LA干預后MDA下降的更為顯著，體現了UVB誘導的急性光損傷以及LA的抗氧化應激以及對抗光氧化損傷效應。研究時發現，LA與正常的角質形成細胞共培養4 h、12 h，ROS和MDA含量較陰性對照組并沒有發生明顯變化(數據未列出)，可能LA沒有改變內環境正常細胞的氧化應激狀態，在氧化壓力增高時才發揮抗氧化作用。

在抗氧化體系檢測方面，結果顯示UVB照射后各組細胞的總抗氧化能力均未發生顯著變化(見圖5和表1)。分析原因，可能是角質形成細胞抗氧化酶整體水平表達低下，難以出現統計學上的差異，提示我們今后需要進一步的研究，更準確的對抗氧化系統進行定量。

綜上所述，本部分研究證實了UVB照射能夠引起原代角質形成細胞氧化應激損傷，與10 mmol/L的過氧化氫誘導的氧化應激的陽性對照結果一致，LA通過降低ROS和MDA含量能夠有效的減輕UVB照射引起的氧化應激損傷。實際上LA作為一種天然抗氧化劑，其廣譜抗氧化能力能夠對抗多種氧化損傷帶來的病理生理損傷，值得深入研究。