間充質干細胞來源外泌體在皮膚損傷修復中的研究進展

孫璇 ，毛念渝 ，劉明珠 ，董傳明 .南通大學杏林學院，江蘇南通 600；.南通大學醫學院，江蘇南通 600

皮膚約占人體表面積的70%，是人體最大的器官，具有保護身體、排汗、感覺溫度變化、同時還參與機體免疫反應。常見的皮膚損傷包括創傷、燙傷、燒傷等，其中難愈性皮膚損傷以及損傷后引起的瘢痕，會導致機體相關組織或器官生理功能的降低，嚴重瘢痕甚至可以導致畸形，給患者帶來極大的肉體和精神上的折磨，也造成了巨大的經濟負擔，這也使得皮膚損傷的修復成為科研臨床工作者迫切想要解決的問題。近年來隨著再生醫學的蓬勃發展，干細胞治療已成為皮膚損傷最具潛力的治療手段之一。間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潛能、免疫調節及分泌多種生物活性物質的能力等，但是其作用機制和臨床療效還需更深入的論證探究[1]。間充質干細胞來源廣泛，存在于體內多種組織中，如骨髓、臍帶、羊水、胎盤、脂肪、女性經血及其他組織中。研究結果顯示，間充質干細胞可能通過旁分泌外泌體(exosomes)來調控新生血管生成，促進細胞增殖從而起到對皮膚損傷的修復作用。外泌體是干細胞分泌的脂質分子膜包裹的小囊泡[2]，近幾年來的研究證實外泌體在皮膚組織損傷修復中起到關鍵作用。

1 皮膚損傷修復過程

皮膚損傷的修復是一個非常復雜的生物學過程，其修復過程主要包括5個階段，即：止血期、炎癥期、增生期、成熟期和重塑期。整個修復過程需要經過緊密的細胞編排、整合、分化、遷移、增殖、凋亡等一系列過程才能恢復皮膚結構的再生，其中一個重要步驟是重塑期時新生血管的生成，將直接影響修復效果[3]。

近年來細胞凋亡在皮膚損傷修復過程中的作用機制引起了研究人員的極大興趣，凋亡是由多基因控制的由細胞主動爭取的有序變化的死亡過程，細胞在接受凋亡信號后，凋亡調控分子間的相互作用，活化蛋白水解酶，接著進入連續反應過程。當細胞的增殖與凋亡處于一定程度的平衡狀態時可以促進皮膚損傷的修復，當這種平衡被打破，便會引起皮膚損傷的異常愈合[4]。

2 間充質干細胞

2.1 間充質干細胞的分類

間充質干細胞屬于多能干細胞，間充質干細胞有很多種類，目前能夠從骨髓、脂肪、羊水、臍帶血等組織中分離提取間充質干細胞。近年來，因其具有多分化潛能、免疫調節和自我復制及多種生物活性物質的分泌能力等特點而逐漸引起人們的關注，可作為理想的種子細胞用于組織器官的損傷修復。

近年來，骨髓間充質干細胞是細胞治療中最常見的間充質干細胞類型。然而由于操作的侵入性強，提取的產量低，增殖速度慢等缺點限制了其可用性。近年來一種新型的間充質干細胞被發現并分離提取，即經血干細胞[5](menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)。子宮作為人體中具有超強再生能力的器官，其子宮內膜會在婦女育齡期經過500次左右有規律的脫落和再生。MenSCs即來源于女性月經期間脫落的子宮內膜，它通過月經血排出體外。由于可以無創和安全地從所有育齡婦女中通過采集月經血獲得[6]，因此，經血干細胞具有巨大的臨床應用前景。

2.2 間充質干細胞臨床應用的安全性問題

盡管間充質干細胞移植在皮膚損傷修復領域顯示出良好的臨床應用前景，但是直接移植間充質干細胞仍然存在一定的風險。在MSCs制備過程中要充分了解供者的年齡、健康狀況、既往病史及家族遺傳史，明確各項指標是否符合要求，盡量避免MSCs的干擾因素，在制備儲存應用過程中需保持無菌環境，排除受者的醫源性感染，建立嚴格的管理規范制度，保護好供者的安全、健康、權益問題[7]。

此外，MSCs表面主要組織相容性復合體抗原表達較弱，不表達HLA-DR等，受者的機體免疫系統不能充分識別這種未分化的細胞，所以當異源的間充質干細胞進入體內時，引起細胞突變，增大了腫瘤的風險[8]。在移植過程中，間充質干細胞如果沒有被完全打散，有就堵塞微小血管而導致血管栓塞，從而導致局部組織缺血壞死。

3 外泌體對皮膚損傷修復的機制

研究表明，真正到達損傷部位并增殖分化為特定組織類型細胞的間充質干細胞僅占很小的比例，間充質干細胞進行損傷修復的主要機制是旁分泌作用[9]。外泌體作為一種重要的旁分泌因子，在皮膚損傷修復中起到關鍵作用。

3.1 外泌體的生物學特性

外泌體是一種脂質分子膜包裹的小囊泡，直徑約為70～160 nm。外泌體來源于細胞核內體系統，由多囊泡體內陷腔化形成并通過多囊泡體與細胞膜融合而釋放到細胞外環境中。最早于1983年有研究人員[10]發現了外泌體的釋放，但直到發現外泌體轉運包括microRNAs、功能性蛋白質等生物活性因子才激起了人們的興趣。自此，對于外泌體研究的興趣持續增加，研究方向包括了外泌體作為細胞間信號介質、疾病生物標志物，藥物轉運載體或者治療的制劑。外泌體包括脂質、膜、胞質蛋白以及microRNA等物質，這些成分使得外泌體成為細胞間通訊的重要途徑。外泌體是旁分泌的一個重要組成部分，它提供了一種非傳統非接觸的長距離細胞間通訊方式。

越來越多的實驗證實，間充質干細胞通過旁分泌外泌體，促進表皮細胞的遷移和生長。除此以外，外泌體還具有免疫抑制的功能，能調節免疫細胞中各種炎癥因子的分泌如白細胞介素（Interleukin,IL）IL-6/IL-10、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）TNF-α等，而又因其半衰期較長，可考慮作為臨床疾病的無創或微創診斷手段，有效減少患者的痛苦[11]。

3.2 外泌體具有促進血管新生的作用

血管再生是間充質干細胞分泌的外泌體促進皮膚損傷修復的主要機制之一。血管再生包括動脈、靜脈以及毛細血管的再生，主要是通過促進平滑肌細胞和血管內皮細胞的增殖和遷移來修復已損傷血管的內皮細胞[12]。Zhang等[13]在促進大鼠燙傷創面的愈合的實驗中，發現來源于臍帶間充質干細胞的外泌體含有豐富的Wnt蛋白，它能活化β-catenin信號通路，促進創傷后血管的重建新生和膠原蛋白合成,從而促進皮膚損傷修復。Zhang等的研究表明，內皮祖細胞來源的外泌體可通過激活Erk1/2信號通路上調成血管基因如VEGFA，Cox-2，FGF2等的表達，增強人微血管內皮細胞的增殖、遷移，促進新生血管形成，提高糖尿病大鼠難愈性皮膚傷口的愈合[14]。Wang等[15]獲取的外泌體來源于一種新近發現的間充質干細胞，即女性月經血的經血源性子宮內膜干細胞。通過microRNA芯片篩選后，發現microRNA-21表達最高,microRNA-21作用于靶基因PTEN,并激活下游的PTEN/Akt信號通路，發揮促血管新生和抗心肌細胞凋亡的作用。

3.3 外泌體具有抑制瘢痕形成的作用

皮膚損傷修復過程中的一個重要的細胞是成纖維細胞。在傷口愈合過程中，成纖維細胞有助毛囊的形成，從而降低皮膚愈合過程中瘢痕形成的幾率。另一個重要細胞是肌成纖維細胞，它在皮膚損傷修復過程中起到組織收縮的作用。但是在病理情況下，肌成纖維細胞的持續存在會引發皮膚創面過度收縮從而導致増生性瘢痕形成。

Fang等[16]研究表明，臍帶間充質干細胞來源的外泌體在小鼠背部皮膚全層創面缺損模型中可通過減少肌成纖維細胞在皮膚損傷后的過度聚集，來抑制瘢痕形成。該課題組通過高通量轉錄組測序發現外泌體中富含microRNAs，主要成員有miR-23a,miR-21等，通過阻斷TGF-β/SMAD2信號通路，減少膠原沉積，抑制肌成纖維細胞的形成，從而起到抑制瘢痕形成的作用。Hu等[17]在皮膚全層損傷模型中發現，脂肪間充質干細胞來源的外泌體能刺激成纖維細胞的增殖、遷移，促進膠原蛋白的合成，增加PCNA，cyclin-1，N-cadherin的表達，從而抑制瘢痕形成、促進皮膚傷口的愈合。

4 外泌體制備過程中的問題

目前學者認為獲得外泌體分離的金標準是超高速梯度離心法，但是所獲得的外泌體提取量并不充足，且耗時耗力效率低下，不適合大量制備。隨著研究工作的深入，緊接著有了外泌體提取盒的出現，外泌體提取盒一方面可以節約培養基另一方面也減少了操作步驟，但是其價格昂貴，未能大量應用于臨床。期望在將來的研究中，可以找到外泌體提取盒的平價替代品。