呼吸道感染嬰幼兒血清模式識別受體RIG-I和MDA-5表達的意義

蔣珍鳳 王恩智 童夏生

天然免疫是機體的第一道防御系統，在感染性和非感染性疾病中都起著重要作用[1-2]。病毒或微生物感染后，機體的天然免疫反應會被激活，病原體相關分子模式通過不同的模式識別受體識別和清除病原微生物。模式識別受體包括Toll樣受體、核苷酸結合寡聚化結構域受體和維甲酸誘導基因-I（RIG-I）樣受體等家族[3]。嬰幼兒期呼吸道感染最常見的疾病之一，大多由病毒感染引起，主要為呼吸道合胞病毒（RSV）和流感病毒。研究發現，模式識別受體與呼吸道病毒感染有關，但RIG-I樣受體家族RIG-I和黑素瘤分化關聯基因5（MDA-5），與嬰幼兒呼吸道病毒感染的相關性研究較少[4]。本研究通過觀察RSV感染的毛細支氣管炎和流感病毒感染的急性上呼吸道感染患兒血清RIG-I和MDA-5濃度的變化，探討模式識別受體在呼吸道感染的不同部位及不同種類病毒感染中的作用，為嬰幼兒呼吸道病毒感染的發病機制和可能的靶向治療提供理論依據。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2016年11月—2017年4月臺州市中西醫結合醫院的住院患兒90例，均符合毛細支氣管炎或急性上呼吸道感染的診斷標準[5]。本研究取得患者家屬知情同意，經醫院醫學倫理學委員會審核通過。

1.2 納入及排除標準 納入標準：符合毛細支氣管炎或急性上呼吸道感染的診斷標準；毛細支氣管炎組血清RSV均呈陽性表達，急性上呼吸道感染組流感病毒均呈陽性表達（采用間接免疫熒光法檢測，試劑盒購自西班牙VIRCELL，S.L公司）；病程24～48h；毛細支氣管炎組住院時間為12～14d。排除標準:合并有嚴重心、肝、腎等重大臟器疾病；甲狀腺疾病等免疫性疾病史；惡性腫瘤；2周內有感染病史；最近2周內使用過糖皮質激素。

2 方法

2.1 標本采集 采集患兒靜脈血各2mL，急性上呼吸道感染組和對照組在就診時采集，毛細支氣管炎組分別于患兒就診時（急性期）和治療后（恢復期）采集，標本靜置2h后分離血清（3000r/min離心15min），置于-80℃冰箱貯存，集中檢測。

2.2 血清RIG-I和MDA-5蛋白檢測 采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法，檢測血清RIG-I和MDA-5的蛋白濃度。操作方法：試劑盒和96孔反應板置于室溫，先后在反應孔里加入標品40μL、RIG-I和MDA-5抗體各10μL、混勻、置37℃溫育30min、洗滌、酶標試劑50μL、顯色劑 A 50μL、顯色劑B 50μL、37℃避光顯色 15min、加終止液 50μL，全自動酶標儀450nm波長測量各孔的吸光度（OD值），繪制標準曲線，根據各標本吸光度值在標準曲線上查得相應的濃度。RIG-I和MDA-5試劑盒均購自Bio-Gram 公司（生產批號 SU-B11924、SU-B10697），酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清RIG-I和MDA-5蛋白表達濃度（靈敏度：最低檢測濃度＜0.1ng/mL）。

2.3 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，三組間均數比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Tamhame’s T2檢驗，同組比較采用配對資料的t檢驗，兩變量的相關性采用Pearson相關分析法，P＜0.05為差異有統計學意義（雙側檢驗）。

3 結果

3.1 三組研究對象一般資料比較 毛細支氣管炎（毛細支氣管炎組）46例，男22例，女24例；年齡0.5～3歲，平均（1.62±0.84）歲；急性上呼吸道感染（急性上呼吸道感染組）44例，男18例，女26例，年齡0.3～3歲，平均（1.54±0.88）歲。對照組 44例來自同期在溫嶺市衛生進修學校兒科門診健康體檢兒童，男23例，女 21例，年齡 0.3～3歲，平均（1.47±0.77）歲。三組患兒性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3.2 三組研究對象血清RIG-I和MDA-5表達水平比較 毛細支氣管炎組急性期和急性上呼吸道感染組血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度均顯著高于對照組（P均＜0.01）；毛細支氣管炎組急性期血清RIG-I蛋白濃度顯著高于急性上呼吸道感染組（P＜0.05），兩組間MDA-5蛋白濃度差異無統計學意義（P＞0.05）。毛細支氣管炎組恢復期血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度均顯著低于急性期（P均＜0.01）。見表1。

表1 三組呼吸道感染嬰幼兒血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度比較（ng/mL，±s）

表1 三組呼吸道感染嬰幼兒血清RIG-I和MDA-5蛋白濃度比較（ng/mL，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與急性上呼吸道感染組比較，△P＜0.05；與同組急性期比較，▲P＜0.01；RIG-I：維甲酸誘導基因-I；MDA-5：黑素瘤分化關聯基因5

組別對照組急性上呼吸道感染組毛細支氣管炎組急性期恢復期F值P RIG-I 5.43±1.77 12.37±4.16*MDA-5 7.42±2.07 15.50±4.29*14.60±4.05△*9.94±4.14▲82.63＜0.01 18.19±6.95*12.98±5.54▲58.30＜0.01

3.3 相關性分析 RIG-I和MDA-5表達呈顯著直線正相關（r=0.52，n=134，P＜0.01）。

4 討論

細胞內的模式識別受體由RIG-I樣受體蛋白家族組成，主要成員為RIG-I和MDA-5，兩者在形態學上具有高度同源性，包括2個N-末端半胱氨酸蛋白酶募集反應結構域和解螺旋酶結構域和C-未端抑制結構域，并通過共同的細胞內信號傳導系統觸發機體的天然免疫反應[6]。在細胞質中，RIG-I具有5′端成族的三磷酸鹽的結構，而MDA-5活性結構是具有較長的雙鏈RNA，在外源性的RNA誘導下發生一連串的級聯反應，包括干擾素β和核轉錄因子κB，產生I型干擾素和促進天然免疫反應[6]。通常，RIG-I樣受體蛋白家族分享檢測病毒感染的分子信號結構，目前已證實家族成員間在抗病毒的過程中具有協同作用[7]。RIG-I信號由自身細小的核糖核酸酶分解產物所激活，識別相對較短的雙鏈RNA（小于1kb），MDA5 識別長的雙鏈 RNA（大于 2kb）。由于RIG-I和MDA-5是屬于細胞質的解螺旋酶類，具有認識特殊的非自身的抗病毒RNA標記物，能通過線粒體銜接蛋白信號通路促發抗病毒的免疫反應，起到抗病毒作用，達到控制和清除病原體，減輕炎癥反應、預防免疫介導的組織損傷的作用[8]。

本研究發現，血清RIG-I蛋白的濃度在毛細支氣管炎組急性期高于急性上呼吸道感染組且高于對照組（P＜0.01），提示模式識別受體RIG-I在病毒感染后提升，不同的感染部位或不同病毒其表達水平也不一樣，支持RIG-I通過提升其表達水平起到清除病原體的作用。在毛細支氣管炎組，隨著病情的恢復RIG-I水平也隨之下降，提示在疾病的不同階段RIG-I的表達也不同，表明它與病情相關。相似的結果也見于其他的研究，在流感A型病毒感染后，肺組織RIG-1 mRNA的表達水平下降，認為肺組織損傷、凋亡和水通道的改變與RIG-信號通路有關[9]。在RSV感染小鼠后，肺組織RIG-I和MDA-5蛋白表達水平也增加，與肺組織蛋白酶類表達增加相關[10]。病毒感染的鼻炎患者鼻部上皮細胞的Toll樣受體、RIG-I和MDA-5的表達增強，共同參與識別和清除由于病毒入侵引起的炎癥反應，其表達水平與病毒誘導的鼻黏膜炎癥加重有關，其機制可能是促進鼻黏膜分泌增加IFN-β[11]。

本研究同時發現，毛細支氣管炎組急性期和急性上呼吸道感染組血清MDA-5蛋白的濃度均高于對照組（P＜0.01），提示MDA-5也隨病毒感染后提升，支持MDA-5能通過提升其表達水平起到清除病原體的作用。在毛細支氣管炎組急性期和急性上呼吸道感染組MDA-5蛋白的濃度無差別，提示MDA-5對RSV和流感病毒的感染反應沒有特異性。在毛細支氣管炎組恢復期，MDA-5蛋白的濃度低于急性期，支持MDA-5水平與病情相關，隨著病情的恢復也隨著下降。MDA-5表達水平變化也見于其他的報道。在小鼠鼻內接種流感病毒A型后3天，病毒感染的癥狀加重，鼻黏膜RIG-I和MDA-5的mRNA和蛋白濃度顯著增加[12]。通過相關分析，RIG-I和MDA-5表達呈顯著直線正相關（P＜0.01），提示模式識別受體之間具有協同作用，共同參與病毒感染的炎癥機制。

綜上所述，在呼吸道感染嬰幼兒血清模式識別受體RIG-I和MDA-5表達增加，可能共同參與清除病毒感染，其表達水平隨著病情恢復而相應下降。[本研究受浙江省溫嶺市科技局基金資助項目（No.2015-1-58）支持。第一作者蔣珍鳳現單位為溫嶺市中醫院兒科。]