強骨飲不同劑量對磨損顆粒誘導(dǎo)假體周圍骨溶解的影響*

王曉洛 崔龍慷 孫龍?zhí)?姚華海 劉 全 吳連國

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310005

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是一種標準、成熟的骨科治療技術(shù)，能有效地恢復(fù)關(guān)節(jié)的功能，但關(guān)節(jié)置換術(shù)后期所帶來的并發(fā)癥，即假體松動導(dǎo)致假體周圍發(fā)生骨溶解，給患者帶來極大痛苦，嚴重影響患者生活質(zhì)量。目前，用藥物來預(yù)防或減少無菌人工關(guān)節(jié)松動，研究最多的如他汀類、大環(huán)內(nèi)酯類、非類固醇類、二磷酸鹽類等[1]，有一定的安全性，但副作用較大。我們臨床上采用益氣溫經(jīng)中藥方強骨飲[2]，在防治假體周圍骨溶解方面做了初步探索，取得滿意療效[3]。本研究主要探討不同劑量的強骨飲對磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周圍骨溶解的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器：10%甲醛溶液購自浙江衢州巨化試劑有限公司；10%水合氯醛購自北京生東科技有限公司；青霉素購自華東制藥集團責任有限公司；鈦棒（長1.5cm、直徑1.2cm）購自浙江科惠醫(yī)療器械有限公司；高密度聚乙烯顆粒（平均直徑4～6μm）購自美國SHAMROCK公司；l型膠原C端肽、白細胞介素1βELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；超凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司（SW-CJ-1F）；超聲波細胞粉碎儀購自曙科生超聲設(shè)備有限公司（KS-250F）；離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠（TGL-168）；雙能X線骨密度儀購自Medilinak公司。高密度聚乙烯顆粒混懸液（濃度10mg/ml，高密度聚乙烯顆粒數(shù)量約1.9×108個/ml）的制備方法：于室溫下稱取適量的高密度聚乙烯顆粒，加入95%的乙醇，浸泡消毒后離心約10min，去上清液并置于超凈臺風干，再溶于含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，與17.5%的滅菌電泳凝膠攪拌、混合，最后予以稱重、去皮。

1.2 實驗動物：選用體重250～300g的雄性成年SD大白鼠50只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.3 強骨飲組成及劑型：藥物組成：鹿角霜、蜂房、川芎、骨碎補各20g，忍冬藤、雞血藤各25g，秦艽、防風、杜仲各15g，肉桂10g，黃芪、川續(xù)斷各30g。水煎劑，常規(guī)中藥煎法，每ml含生藥245mg，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥房提供。

1.4 造模方法：空白組不做任何處理，模型組和強骨飲組大鼠先用10%的水合氯醛麻醉，每只大鼠按0.03ml/kg的劑量腹腔注射，待麻醉起效后，將大鼠固定于動物手術(shù)解剖臺上，常規(guī)術(shù)野備皮，消毒，鋪巾，從大鼠右膝內(nèi)側(cè)入路，逐層切開皮膚、皮下組織至關(guān)節(jié)囊，顯露膝關(guān)節(jié)，將髕骨前外側(cè)脫位，屈曲膝關(guān)節(jié)，充分暴露股骨髁，用平行于股骨長軸方向的低速電鉆從股骨髁間窩鉆一深度為15mm、直徑為1.5mm的孔道至骨髓腔。每側(cè)孔道內(nèi)植入100μl高濃度聚乙烯顆粒凝膠和鈦棒，用骨蜜蠟封閉隧道，最后用慶大霉素沖洗傷口并逐層縫合。術(shù)后用青霉素2萬U/100g肌注抗感染，每天1次，連用3天，且每天給予碘伏消毒。

1.5 實驗分組及處理：將50只大鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，強骨飲高、中、低劑量組，每組10只，所有大鼠喂養(yǎng)條件相同，均喂食普通顆粒飼料。空白對照組：不做任何處理。模型對照組：按上述造模步驟完成后不做藥物干預(yù)。強骨飲高、中、低劑量組：造模步驟同前，分別以每100g大鼠灌胃2、1.5、1ml計算給藥量，每周3次，連續(xù)給藥。

1.6 取材：手術(shù)后8周，于麻醉下取大鼠下腔靜脈血，將其置于3000r/min離心機中離心15min，分離血清，-20℃冰箱冷藏待做分子水平檢測用。待取血結(jié)束后用二氧化碳法處死所有大鼠，取出右側(cè)股骨，將周圍組織剔除干凈后放置-20℃冰箱冷藏待做影像學(xué)水平檢測用。

1.7 實驗指標：將冷藏的血清取出，從分子水平用ELISA法檢測大鼠血清中白細胞介素1β（IL-1β）的水平，并分析l型膠原C端肽（CTX-1）的表達變化，取出冷藏的股骨標本，放置室溫下，用雙能X線骨密度檢測儀掃描所有股骨標本，并記錄大鼠股骨骨密度的變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法：本實驗采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以-x±s表示，5組大鼠數(shù)據(jù)之間差異性比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗，當P＜0.05時表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β、CTX-1的檢測結(jié)果：5組大鼠血清IL-1β、CTX-1水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，模型組及強骨飲各組大鼠血清中IL-1β、CTX-1水平均升高，與模型對照組比較，強骨飲各劑量組血清IL-1β、CTX-1水平均降低，其中強骨飲高劑量組較為顯著，中劑量組次之，低劑量組最小。提示強骨飲可降低大鼠血清IL-1β、CTX-1水平，且隨著劑量增加，其降低水平也逐漸加大。見表1。

2.2 大鼠股骨骨密度檢測結(jié)果：5組大鼠股骨骨密度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對照組比較，其余各組大鼠股骨骨密度均降低。與模型對照組比較，強骨飲高劑量組大鼠骨密度顯著高于模型組，中劑量組次之，低劑量組最小。見表1。

表1 各組大鼠股骨骨密度及血清IL-1β、CTX-1水平（-x±s，pg/mg）

3 討論

假體周圍骨溶解極大影響了關(guān)節(jié)置換患者的生存質(zhì)量，其發(fā)生的原因有多種，其中最主要的原因是假體周圍磨損顆粒的產(chǎn)生。研究證實，翻修手術(shù)中取下的壞死組織里可看到大量的磨損顆粒，磨損顆粒通過刺激骨溶解周圍相關(guān)細胞，主要為巨噬細胞，產(chǎn)生大量的炎癥細胞因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等，最終導(dǎo)致破骨細胞的分化生成增多，引起骨溶解的發(fā)生[4]。

中醫(yī)學(xué)認為，腎與骨密切相關(guān)，骨骼的生長和傷痕愈合與腎有密切關(guān)系[5]。如《醫(yī)經(jīng)精義》云：“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也；髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強。”強骨飲中，鹿角霜、骨碎補、肉桂、杜仲、續(xù)斷溫陽益腎，雞血藤、川芎、黃芪益氣活血，忍冬藤、秦艽、防風、蜂房祛風通絡(luò)，共奏補腎助陽、強筋健骨、益氣活血通絡(luò)之功。我們前期大量臨床研究證明[6-7]：強骨飲可顯著降低骨吸收參數(shù)指標，促進成骨細胞的形成，抑制破骨細胞的活性。各種藥物劑量不同，所產(chǎn)生的效果也有明顯差異。IL-1β主要由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生，被認為是激活破骨細胞活性的重要細胞因子。CTX-1為骨代謝標志物，當破骨細胞活性顯著增強時其數(shù)量可明顯增高。

目前研究表明，假體周圍骨溶解所產(chǎn)生的磨損顆粒主要成分為聚乙烯顆粒[8]。本實驗結(jié)果表明，模型對照組大鼠溶骨性細胞因子水平明顯高于空白組，證實了實驗?zāi)Ｐ偷挠行浴Ｅc模型對照組相比，強骨飲組大鼠血清CTX-1、IL-1β水平均降低，其骨密度均比模型組高。且強骨飲劑量不同，其CTX-1、IL-1β水平及骨密度高低均有明顯差異，隨著劑量的增高，血清IL-1β、CTX-1水平逐漸降低，股骨骨密度逐漸增高。綜上，強骨飲可降低血清IL-1β、CTX-1的水平，增加其骨密度，且強骨飲劑量不同，所產(chǎn)生的結(jié)果也有明顯差異。本研究的強骨飲為水煎劑，然而劑型不同能否產(chǎn)生不同的效果，可作為今后研究的一個方向。

4 參考文獻

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[2]徐偉鋒，葉健，吳連國.強骨飲對骨質(zhì)疏松性股骨頸骨折患者全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后血清骨代謝生化指標和骨密度的影響[J].中醫(yī)正骨，2015，27(2)：12-16.

[3]吳連國，劉康，黃俊俊，等.強骨飲對股骨頸骨折患者人工股骨頭置換術(shù)后假體周圍骨密度的影響[J].中醫(yī)正骨，2014，26（4）：15-18.

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[7]吳連國，劉康，王定，等.強骨飲治療骨關(guān)節(jié)炎合并骨質(zhì)疏松患者的臨床研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2011，19(12)：10-13.

[8]李文博，宋科官.磨損顆粒誘導(dǎo)髖關(guān)節(jié)置換后假體周圍骨溶解的相關(guān)生物學(xué)機制[J].中國組織工程研究，2018，22(3)：464-470.