光遺傳學在心臟電生理中的研究進展

熊永紅，李 維，冷 燕，夏中元

(武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060)

光遺傳學是新近出現的一種生物學研究方法，其可以靶向在細胞或組織間表達光敏感蛋白。這些蛋白質最初被發現于微生物內，如藻類和古細菌等，但現已被分離、純化和精制，可以在哺乳動物組織中表達[1]。特定的波長和強度可以誘導從微生物中提取的光敏感蛋白對非光敏細胞的光敏感性。且其誘導產生的離子通量能觸發細胞活性，如動作電位沿軸突傳播的電信號。光學控制動作電位產生和傳播的能力在神經科學領域引起廣泛關注[2]。這種新技術的最大優點在于通過利用基因工程方法以時空精確的方式調節神經元功能。基因工程方法能在特定神經元群體或所需亞細胞位置中表達視蛋白。此外，由于光遺傳學能在毫秒時間尺度上精確控制光脈沖的寬度、頻率和等待時間，所以可以用其來研究體內神經元編碼的潛在行為。研究人員可以選擇性地將光敏感蛋白轉導至細胞亞群，使其對光照敏感，并通過光誘導觸發細胞超極化或去極化來調節細胞、神經或組織的活性[3]。目前，光遺傳學技術已被廣泛運用于神經、癲癇、代謝性疾病、視網膜病、心肌電生理、急性腎損傷及疼痛等領域的研究[4- 6]。現就光遺傳學在心臟電生理中的研究進展予以綜述。

1 光遺傳學概述

自1989年起，高分辨率相機技術以及幾種電位和細胞內鈣傳感器的開發使得光學成像成為心臟研究的有價值工具。電傳導、動作電位和鈣瞬態形態可以在高時空分辨率下直接測量、量化和跟蹤心肌細胞，這是傳統電極技術無法比擬的[7]。

這種新興技術最先在神經科學中被廣泛應用，且越來越多的科研人員在心臟中研究其價值。目前，學者已在幾個實驗模型中報道了心臟制劑的光遺傳起搏[7]。除節律控制外，光遺傳學還被學者用于終止離體和體內嚙齒動物心臟的心律失常，抑制和操縱心肌細胞單層中的轉子并闡明心臟中心肌細胞和非心肌細胞亞群的功能[8- 9]。由于非接觸式操作和高時空分辨率，全光學系統具有獨特的高吞吐量控制能力，能夠研究可激發介質中可能出現的復雜現象[10]。因此，光遺傳學在心臟研究中發揮了關鍵作用，其為心臟的生理學和病理生理學研究提供了新方向，且一些獨有的特征使其成為起搏和心律失常終止的潛在臨床工具。

1.1基本原理 光遺傳學主要利用光照改變細胞膜兩側的離子通透性，當神經元處于靜息狀態時，細胞膜兩邊存在電位差，即靜息電位。靜息電位的產生是由于膜內外各種離子的分布不均衡，以及細胞膜在不同情況下，對各種離子的通透性不同造成。當神經元受到刺激興奮時，在靜息電位的基礎上發生一次擴布性電位變化，稱為動作電位。如給神經元轉入膜通道蛋白[視紫紅質通道蛋白2(channelrhodopsin- 2,ChR2)或嗜鹽菌紫質(natronomonas pharaonis halorhodopsin, NpHR)]。當用473 nm的藍色激光照射時，ChR2通道蛋白的通道打開，允許陽離子(Na+)大量內流，產生動作電位，即讓神經元處于興奮狀態。當用580 nm的黃色激光照射時，NpHR通道蛋白的通道打開，允許Cl-通過，使神經元一直處于靜息電位，即讓神經元保持靜息狀態[11]。

1.2激活神經元的通道蛋白 目前，已發現的激活神經元的通道蛋白包括ChR2及其突變體：ChR2最初在單細胞葉綠素萊茵衣藻中被發現，其在細胞膜上形成陽離子通道[12- 13]。當表達ChR2的細胞受到藍光照射時，離子通道開放導致細胞去極化。ChR2的突變體ChR2(H134R)，將第134個氨基酸由組胺酸突變為精胺酸，該蛋白質可以產生兩倍的光電流，但通道開關速度比ChR2慢一倍。同時，突變體ChR2(E123A)具有4 ms的快速通道開放速度；ChR2(E123T/T159C)具有更大的光電流和更快的動力學變化。此外，ChR2的(E123T/H134R)突變體ChETA，使得神經元在激光刺激下可以發放的頻率為200 Hz，而其他的ChR2通道蛋白只能達到40 Hz。C1V1是由ChR1及由團藻發現的VChR1組合在一起的通道蛋白，在紅色激光刺激下打開通道[14]。

1.3抑制神經元活動的通道蛋白 抑制神經元活動的通道蛋白包括NpHR、古紫質等。其中，NpHR是第一個被發現的能有效抑制神經元活動的光遺傳學工具，在黃綠激光照射下Cl-進入神經元內，從而抑制神經元活動[15]。NpHR在哺乳動物腦內表達時，其會聚集在內質網上表達，但不能在神經元細胞膜上高量聚集。古紫質是一種黃色激光激活的外向整流質子泵，其能將帶正電的質子從神經元內移動到細胞外環境中，使神經元處于超極化狀態，從而保證神經元處于靜息狀態。與NpHR相比，當激光關閉時，古紫質從通道打開狀態恢復為關閉狀態。褐斑鉤端螺旋體真菌視蛋白——藍色激光激活的質子泵，其能使神經元保持超極化狀態，從而保證神經元處于靜息狀態[14]。

2 光遺傳學與心臟電生理

人的心臟含有數十億個心肌細胞，每個心肌細胞(100 μm×20 μm×20 μm)均包含收縮單位，稱為肌節；每個肌節之間以2 μm的距離排列，可通過光遺傳學技術打開或關閉這些肌節從而改變心肌細胞特性[16]。光遺傳學技術于2010年首次在斑馬魚和大鼠中用于心臟研究，在斑馬魚模型中ChR2和NpHR的轉基因表達被用于研究心律[17]。且在該研究中，學者將光遺傳學和光學顯微鏡結合起來，在斑馬魚發育過程中對心臟起搏器活動的起源進行空間映射，并發現光遺傳學方法精準觸發了可逆性節律紊亂。Bruegmann等[18]開發了一種表達ChR2- (H134R)的轉基因小鼠胚胎干細胞系，并研究其在體外和體內的功能。結果發現，表達ChR2小鼠的心肌細胞和心臟組織通過光刺激誘導，導致鈣離子釋放去極化，從而產生了竇性心律失常和心臟異位起搏。

光遺傳學提供了一種通過光與光門控離子通道的相互作用來控制可興奮細胞電活動的方法。目前，光遺傳學已被廣泛應用于神經科學，但它很少被用于研究心臟病理生理學。然而，干擾心臟電活動的光學方法具有很多優點，特別是當完全利用光的時空特性時[19]。心肌細胞的功能障礙和心肌細胞間的相互作用與多種心血管疾病有關，包括心律失常和心力衰竭[20]。雖然大多數分子心臟病學研究已在體外研究了分離的心臟細胞，但由于技術困難仍未能闡明心臟的細胞網絡。此外，考慮到電刺激無論是治療還是研究均缺乏特異性，所以心臟光遺傳學有望成為心律失常及心臟起搏治療的替代方案，且由于其靈活性高侵襲性小，目前已成為研究心血管疾病的主要技術[21]。

2.1心臟起搏 自1950年起，心臟起搏治療發展非常迅速。20世紀50年代后期，伴隨右心室最先被起搏，起搏器引起的不同步風險已變得逐漸明顯。雙心室起搏雖然解決了不同步的問題，但僅對某些患者有益(主要由于左束支傳導阻滯和持續時間≥150 ms，左心室功能下降)[22]。因此，研發一種新的干預措施對心臟停搏患者的治療和預后非常重要。Bruegmann等[18]光誘導ChR2在小鼠體內對心肌細胞進行刺激，該方法能實現精確的心肌細胞局部刺激和心臟組織的持續去極化，從而恢復心臟節律。Ambrosi等[23]進一步研究開發了一種新方法，即使用光遺傳學進行選擇性細胞特異性興奮，其中光學激發閾值可用治療效率來表達。其主要用于測試心臟組織在治療后結構功能關系，并恢復心肌細胞興奮性。Yamamoto等[24]將興奮性陽離子通道ChR2遞送至大鼠腦中孤束核，刺激轉導的神經元，結果顯示膈神經元和交感神經元活動增加，平均動脈壓和心率升高。Wengrowski等[25]使用轉基因小鼠，使ChR2在小鼠兒茶酚胺能交感神經元中表達，給予光刺激，測量心律失常的發生率，并對心臟進行光學映射以檢測動作電位持續時間和傳導速度的變化，結果表明交感神經纖維的光刺激使得心臟更容易發生心律失常，且發病率和嚴重程度更高。可見，光學刺激增加了交感神經末梢的活動，增加了心肌收縮力和心率，縮短了動作電位持續時間，并增加了心臟異位起搏和心律失常。

雖然光遺傳學運用于心臟的可行性已被證明，但目前的光學刺激技術無法對持續的心臟損傷及時做出反應。Scardigli等[26]開發了一個全光學平臺，以實時調控心電活動。該方法可在房室傳導阻滯后恢復正常電活動并恢復心室內正常傳播，同時也可用于模擬穿過心室的重入電路。這種創新的光學方法的發展為實時光刺激在正常和異常條件下控制心律，提供了一個可行的方案。

2.2心臟除顫 心室顫動是心源性猝死的最常見原因[27]，其唯一治療方法是通過提供強大的電擊來進行除顫。除顫器的植入是一種使用廣泛且有效的治療方法；但由心臟周圍可興奮組織的側支電信號通路激活可引起心前區疼痛，故迫切需要研究不需要高能量沖擊以替代心室顫動的治療方法。光遺傳學是一種選擇性刺激心臟的方法，是電除顫的理論替代方案，涉及在心臟中表達光敏離子通道(通過基因或細胞療法)和心臟表面的照射(通過植入的LED燈)以引發光誘導的激活。與目前臨床使用的電除顫儀相比，光遺傳學技術除顫使用的能量更少，避免了心肌細胞的直接損傷；且特異性靶向技術可以避免刺激周圍神經肌肉引起的疼痛不適[28]。

Karathanos等[29]使用基于生物物理的人體心室模型來確定光刺激療法是否可以終止心室顫動，并確定光敏離子通道特性和照明配置的哪些組合是匹配且有效的。結果表明，當大部分(>16.6%)心室組織被足夠明亮的光直接刺激在未偶聯的細胞中誘導動作電位時，除顫成功。Nyns等[8]的研究表明，對進行光遺傳學轉染的成年大鼠心臟進行簡單的局部心外膜照射，可以利用光誘導終止室性心律失常。

2.3室性心律失常 目前，室性心律失常是一個日益嚴重的問題，其發病率和死亡率很高[30]。雖然室性心律失常的治療方法取得了重大進展，但目前其治療方案仍不理想。即藥物治療沒有明顯效果，而導管消融可能導致不可逆的并發癥。電擊療法可有效終止室性心律失常，并已顯示可降低死亡率，如植入式心臟除顫器。然而，上述裝置所傳遞的高壓電擊會造成皮膚創傷，且還與嚴重的疼痛、焦慮和抑郁、心肌組織損傷有關[31]。光遺傳學是一種新興的生物技術，其使用光門控離子通道以特定、可逆和無損傷的方式電調節細胞、組織和器官。因此，光遺傳學可能為生物學和疼痛的發展提供新思路。研究表明，心臟光遺傳學允許整個心臟的光學起搏和細胞培養中光誘導的心律失常終止[32]。現階段主要研究成年大鼠心臟的光遺傳學修飾是否能夠實現光介導終止室性心律失常。可見，光遺傳學已成為治療心律失常的潛在替代方案。Boyle等[33]通過纖維化患者心房核磁掃描重建的計算模型來探索光遺傳終止房性心動過速的可行性，并比較了分布式和靶向式兩種不同照射的區別。結果顯示，在成功將光敏感蛋白基因ChR2遞送到心肌細胞時，模擬顯示持續長于房性心動過速周期的目標光脈沖可有效終止房性心動過速。

Yu等[34]在研究中以腺相關病毒為載體將古紫質T遞送至左星狀神經節。結果顯示，運用發光二極管照明顯著抑制了左側星狀神經節功能、左側星狀神經節的神經活動及改變心率變異性的交感神經指數和左心室有效不應期；30 min的光照進一步增強了光遺傳學組的這些變化，且所有這些變化在照明關閉后2 h內恢復到基線。此外，在光遺傳學組中通過光照降低了缺血誘導的室性心律失常的發生頻率。以上研究表明，光遺傳調節可以可逆地抑制左側星狀神經節的神經活動，從而增加心肌電生理穩定性并防止心肌缺血誘導的室性心律失常。Yu等[34]研究的另一個重要發現為光遺傳學可通過心外膜表面的一小塊區域成功終止室性心律失常。因此，可以預想通過將目的光源聚焦在相對較小的心臟表面來治療心律失常。

3 小 結

在心臟疾病的診療和預防中，與常規電除顫和藥物治療方法相比，光遺傳學技術有顯著優勢。在心臟研究中，光遺傳學方法已用于解釋體外和體內細胞的相互作用。除心臟起搏和心律失常外，光遺傳學方法還可用于細胞水平研究，使研究人員能夠獲得組織水平和細胞水平的基本特性[35]。鑒于該領域在臨床的應用前景，光遺傳學可能會在心臟學科的預防和治療上有突破性進展。雖然光遺傳學目前仍有很多技術問題待解決，但光遺傳學是一條創新性道路，其能為治療心血管疾病，特別是為替代電除顫研究提供新方法和思路。