PLGA納米材料在缺血性腦卒中中的應用

郭 橋，蔡 強，李知陽，王文舉，陳治標

(武漢大學第一臨床學院 武漢大學人民醫院神經外科，武漢430061)

腦卒中是腦部缺血或出血導致神經功能障礙的疾病，是引起死亡的第二大原因，常發生于老年群體，且有年輕化的趨勢[1- 2]。我國腦卒中年發病約為200萬，年新發病例約為150萬，死于腦卒中的患者約130萬，幸存者中75%不同程度地喪失勞動能力[3]。缺血性腦卒中又稱為腦梗死，是由于栓子或血栓使腦部供血不足從而導致腦組織缺血缺氧引起腦組織與功能損傷的疾病，約占卒中人數的87%[3- 4]。靜脈溶栓及機械取栓療法是目前早期治療缺血性腦卒中的主要方法，其時間窗及適用范圍較窄[5]。只有5%的患者受益于重組組織型纖溶酶原激活劑治療[6]。通過阻斷導致神經元死亡的分子通路或增強神經元的存活和再生，已經開發出多種治療腦卒中的藥物，但除了重組組織型纖溶酶原激活劑外，其他很少在臨床試驗中成功[7]。由于現有很多藥物存在溶解度低、半衰期短等藥動學缺陷，在血腦屏障的存在下，藥物很難到達腦組織損傷的部位，影響了藥效的發揮[8]。新近發展的納米技術可幫助藥物顯著擴大其藥動學的局限性，在腦血管疾病的治療中具有潛在的應用價值。納米材料的粒徑小，比表面積大(每克物質中所有顆?？偼獗砻嬷?，并且能對其進行各種靶向修飾，改變其脂溶性等特性，適合作為腦部的載藥系統，不僅能夠裝載疏水性或親水性藥物以及基因藥物，還能成為影像學探針[9]。大腦局部缺血或損傷都會激活成年哺乳動物腦內的內源性神經發生[10]。利用納米纖維作為神經細胞生長的支架和營造神經細胞生長分化的微環境，成為神經修復的熱點?，F就納米聚乳酸- 羥基乙酸共聚物[poly(lactic- co- glycolic acid)，PLGA]納米材料在缺血性腦卒中中的應用予以綜述。

1 PLGA納米材料應用于腦部給藥

血腦屏障是生理性的屏障，存在于血液和腦組織之間，能夠有效阻止血液內的有毒物質進入腦組織，保證腦組織處于相對穩定的微環境。同時也使得大部分藥物難以進入腦組織發揮作用[7]。包括多肽和基因藥物在內98%的小分子藥物及大約100%的大分子藥物是無法通過外周給藥途徑進入腦組織的[11]。缺血性腦卒中后7 d內雖然血腦屏障有所破壞通透性增加，但還遠不能達到具有治療效果的藥物濃度，而傳統的使藥物進入腦的途徑有經鼻給藥；增加藥物的脂溶性；破壞基膜的緊密連接蛋白使血腦屏障暫時打開等。但這幾種途徑也都有其各自的缺點：小分子藥物通過增加脂溶性后可通過血腦屏障，但容易被血腦屏障上的外排泵及通道再次排出；活躍的射流泵或轉運體，在大腦內皮細胞的腔膜高度表達，可以積極地將物質排回血流，進一步加強血腦屏障；P- 糖蛋白、多藥耐藥蛋白、腺苷三磷酸結合盒轉運蛋白是最具特征的外排泵[12]；增加血腦屏障的通透性使藥物進入腦的同時也增加了有毒物質進入腦的可能，從而導致其他損傷腦的疾病發生。因此，開發新的載藥系統以更有效地將藥物遞送到腦損傷病灶區，已成為當前腦部疾病治療領域的研究熱點。

生物降解聚合物(天然聚合物和合成聚合物)是近年來生物醫學治療藥物傳遞過程中最受歡迎的材料，它提供了靶向給藥的靶點分布。聚合物的物理化學性質和降解性能可以很容易改變藥物的控釋和降解速率，不同聚合物的降解速率決定了哪種藥物分子將被裝載到交付過程中[13]。生物降解聚合物納米粒(nanoparticles，NPs)材料主要分為合成生物可降解聚合物和天然大分子體系。聚生物降解聚合物包括乳酸、聚乙醇酸、PLGA、聚己內酯和聚乙二醇[poly(ethylene glycol)，PEG]；天然聚合物由殼聚糖、多糖、明膠、淀粉等組成。近年來，生物降解聚合物已廣泛應用于缺血性腦卒中的治療中，也是寡核苷酸、蛋白質和小分子藥物遞送系統的選擇[7]。PLGA是由兩種單體(乳酸和羥基乙酸)隨機聚合而成的高分子有機聚合物，易合成，質量穩定，具有良好的生物相容性和生物可降解性，且無毒、無刺激性、無免疫原性，并具有較高的包封率，可將藥物遞送到病灶部位以實現可控性釋放，已被美國食品藥品管理局批準用于組織工程、醫用材料、藥物遞送載體等領域[14]。PLGA NPs在體內可水解成乳酸和羧基乙酸兩種單體，通過三羧酸循環最終代謝成二氧化碳和水，對人體不會產生不良反應。PLGA NPs顆粒粒徑小，采用PLGA制成的納米藥物具有較高的細胞攝取率。Musumeci等[12]將奧卡西平包載入PLGA NPs中改進傳統鼻腔給藥治療小鼠癲癇，結果顯示對比傳統鼻腔給藥PLGA NPs包載藥物的給藥次數減少到1/24 h，并控制了大鼠的癲癇發作；免疫組織化學(抗- 神經絲、抗- 微管蛋白、抗- 胱天蛋白酶3)顯示，奧卡西平PLGA NPs治療16 d后具有神經保護作用。有研究表明，損傷的腦微血管內皮細胞過表達組織因子，融合蛋白增強綠色熒光蛋白- 表皮生長因子1可靶向該因子。Chen等[15]將負載組織因子- 增強綠色熒光蛋白- 表皮生長因子1- PLGA納米顆粒作為靶向載體用于損傷的腦微血管內皮細胞，然后納米顆粒對轉錄因子產生細胞內RNA進行干擾，研究結果表明，載組織因子- 增強綠色熒光蛋白- 表皮生長因子1毒性最小，轉染24 h后，幾乎96%的細胞存活，而脂質體轉染的細胞只有75%存活。主要的PLGA NPs的制備方法有復乳溶劑蒸發法、納米粒沉淀法等。制備方法的不同影響著其粒徑的大小和包載率，其中采用復乳溶劑蒸發法所獲得的納米粒的粒徑較小，且有良好的穩定性和生物相容性[16]，而納米粒子的體積/表面積比例會隨著納米粒粒徑的大小而變化，大分子納米微粒載藥較多但釋放藥物不均勻，不徹底。 Cruz等[17]用腦損傷的小鼠模型證明了PLGA NPs大小是決定其到達腦損傷區能力的關鍵因素。有治療效果的神經保護藥物已很多，進一步改進PLGA納米材料作為藥物載體的性質，使治療藥物達到缺血性腦損傷部位，實現口服給藥甚至局部給藥是將來的發展方向。

2 PLGA納米材料應用于缺血性腦卒中的藥物治療

導致腦組織損傷的病理生理機制包括興奮性毒性、鈣超載、自由基損傷、炎癥反應以及神經元凋亡等。由于很難達到腦損傷部位，故大多數藥物在臨床中效果不顯著。Mukherjee等[18]將姜黃素結合PEG化的PLGA納米顆粒，給老年大鼠口服，結果顯示活性氧類標志物及損傷面積比只給姜黃素的對照組明顯減少。PLGA載體增加了姜黃素的生物可降解性，增加了腦內的藥物濃度。Gao等[13]將納米氧化鈰包裹在PLGA- PEG共聚物基質上，與對照組相比，制備的氧化鈰納米顆粒聯合PEG/PLGA基質具有更好的療效，使局部缺血減少60%，腦水腫減少78%。將傳統的神經保護藥物搭載在PLGA NPs上確能增加藥物治療缺血性腦卒中的療效，這主要是因為搭載藥物的PLGA NPs能通過血腦屏障，增加藥物在腦組織的濃度。但目前的研究主要還是動物實驗，Mdzinarishvili等[19]利用PLGA- PEG包裹三碘甲腺原氨酸通過頸靜脈給藥，證明在缺血性腦卒中模型中注射PLGA- PEG- 三碘甲腺原氨酸溶液比單獨注射三碘甲腺原氨酸具有更好的療效。Chaturvedi等[20]利用PLGA搭載基質金屬蛋白酶組織抑制物1可起到藥物緩釋作用，結果顯示，較單獨使用金屬蛋白酶組織抑制物1有顯著的神經保護作用。除了將藥物搭載在PLGA上，NPs表面工程還可增強納米載藥系統的靶向性，提高溶解度，延長半衰期，降低免疫原性，改善生物分布。多數研究在使用PLGA時多利用PEG涂層，PLGA NPs表面覆蓋PEG脂質層，以減少非特異性結合，提高血液半衰期，并允許特定配體的結合，而通過不同的PLGA 表面修飾可達到靶向損傷部位和不同治療目的的效果[15,19- 20]。另外，還可將納米顆粒裝載在生物載體內(如酵母衣殼和巨噬細胞)，實現口服給藥或靶向目的。Pang等[21]通過與M1型巨噬細胞共孵育PLGA納米顆粒制備M1型巨噬細胞負載納米顆粒治療腦膠質瘤，M1型巨噬細胞在顆粒加載后仍保持良好的腫瘤趨向性，能夠有效地使顆粒穿過內皮屏障進入腫瘤組織。納米材料能跨過血腦屏障是治療缺血性腦卒中的首要部分，而實現藥物準確而有效地靶向損傷腦組織達到治療效果，還需要進一步研究發現有效的配體或生物載體。

3 PLGA納米材料應用于缺血性腦卒中后的組織修復

替代因腦卒中而失去的腦組織仍然是一個重大挑戰。腦卒中后的功能障礙是由神經元死亡引起的，因此，替代這些丟失的神經元有可能逆轉功能障礙。神經干細胞植入大腦后可以分化為神經元，神經元整合到剩余的宿主大腦，并通過整合到現有的神經網絡和(或)通過刺激血管生成進而改善神經功能，而促進一些行為恢復。但神經干細胞的分化和功能的完善需要一定的微環境和基質支持。在胎兒和成人組織中，細胞外基質約占腦容量的20%[22]。將人神經干細胞與去細胞化細胞外基質生物支架結合，也可實現神經干細胞在病變腔內的高效分布。Bible等[23]利用在釋放血管內皮生長因子的PLGA微粒上植入人神經干細胞，與去細胞化細胞外基質生物支架結合，可以促進微血管的形成，為新生組織的生長提供氧氣和營養。微環境決定著神經干細胞的分化生長。Ropper等[24]的研究利用PLGA制成的支架和人間充質干細胞治療大鼠脊髓損傷模型，使成年大鼠脊髓損傷后的運動感覺得到明顯改善，疼痛和組織損傷得到緩解，髓鞘得以保存。該研究將人神經干細胞播種在設計獨特的PLGA 基質中，以提高供體干細胞在非分化狀態和局部移植中的存活率，從而促進植入- 宿主在體內的相互作用，對于缺血性腦卒中的神經修復具有啟示意義。Ju等[25]用透明質酸為基礎的可生物降解水凝膠支架，與含有血管內皮生長因子和血管生成素1 的PLGA微球混合制成的生物材料復合材料植入大腦的損傷區域，在體外實驗中發現人臍動脈內皮細胞和神經干細胞在體外PLGA微球透明質酸水凝膠上具有良好的存活和增殖能力；該新材料植入小鼠正常或缺血腦后，與腦組織具有良好的相容性，小鼠模型明顯表現出行為改善。以往認為神經干細胞發生只存在于胚胎發育過程中，而成人的中樞神經系統不能產生新的神經元。但近年來的研究發現，在成年哺乳動物中樞神經系統存在著神經干細胞聚集區，腦組織缺血及損傷會激活內源性神經干細胞的分化，這種神經發生主要存在于腦室管膜室下區和海馬齒狀回的顆粒層下區兩個神經源性腦區[9]。Petro等[26]利用PLGA包載抗氧化劑過氧化氫酶和超氧化物歧化酶治療缺血性腦卒中模型小鼠，促進內源性神經干細胞的發生。Wang等[22]將表皮生長因子和促紅細胞生成素封裝在PLGA NPs和聚癸二酸涂層組成的兩相微粒子中治療缺血性腦卒中模型小鼠，結果發現NPs成功穿過血腦屏障，并促進內源性神經干細胞的分化，小鼠神經功能有顯著的恢復。組織工程和細胞工程的發展對于缺血性腦卒中以及其他腦部損傷疾病的神經功能恢復相當重要。PLGA納米材料良好的生物相容性對于應用腦損傷組織修復有進一步的研究價值。

4 PLGA納米材料用于缺血性腦卒中的影像診斷

缺血性腦卒中和其他許多顱腦疾病一樣，有炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡等過程的參與。Guo等[27]報道了一種功能化環糊精制備的髓過氧化物酶的合成和表征，以該功能材料為基礎的納米粒子，在炎癥條件下，活性氧和髓過氧化物酶異常升高，激發出明顯的高、可持續的發光信號；利用這種納米探針可以選擇性地成像炎癥反應中激活的中性粒細胞，其發光信號與中性粒細胞計數呈正相關，且這種納米探針能夠在體內精確定量和跟蹤各種炎性疾病。將納米微粒載體配上相應的配體(如修飾抗中樞神經系統損傷的生物標志物——S100鈣結合蛋白B、血管細胞黏附分子、膠質原纖維酸性蛋白等)，利用計算機斷層掃描或磁共振成像可以快速檢測出損傷部位和范圍[28]。Cruz等[17]將一種800 CW的藍色染料結合到PEG- PLGA NPs上，利用NPs的穿透性和800 CW能與死亡細胞蛋白結合的能力，達到靶向標記腦損傷部位的目的。臨床使用的各種溶栓藥物血漿半衰期短、靶向性低、易引起出血等并發癥，因此早期發現血栓、局部溶栓治療是有吸引力的。Zhou等[29]的Fe3O4型PLGA NPs體外和體內實驗均證實，該NPs特異性地積聚在血栓邊緣，具有顯著的溶栓作用，證明了NPs作為一種雙功能工具在血栓早期檢測和磁共振成像溶栓效率動態監測中的潛力。缺血半暗帶的成像，挽救更多的腦組織是早期影像診斷的目的，PLGA納米探針的準確性還需要進一步提高，這需要找到合適的標志物。

5 小 結

PLGA作為生物材料植入腦組織的研究較少，無論是利用內源性還是外源性干細胞替代缺損組織，都需要良好的微環境，PLGA具有很好的利用價值。隨著納米技術的發展及分子探針在影像學中的應用，影像醫學已從對傳統的解剖和生理功能深入到分子水平成像。PLGA可作為在活體狀態下從細胞和分子水平對生物過程進行可視化的定性和定量研究的探針的良好載體。缺血性腦卒中的診斷和治療對時間的要求很高，早期診斷和治療決定著患者的預后，腦卒中后有7d窗口期，此間血腦屏障通透性增強利于輸送藥物，但這對于達到治療效果還不夠。有效的神經保護藥物必須能在通過外周和其他中樞神經系統屏障后仍然保持其特性，并且能在血腦屏障功能逐漸恢復或完好時有效地通過血腦屏障達到病灶，PLGA納米材料有望成為缺血性腦卒中的診療工具。