免疫細胞調控創面愈合的研究進展

何秀娟 張金超 劉青武 林 燕 李 萍

一、急性創面

創面愈合是個復雜而又有序的病理生理過程，通常分為凝血、炎癥、增殖和重塑共4個階段。血小板最先到達創面，啟動凝血級聯反應防止血液流失，并為后續的細胞浸潤提供臨時細胞外基質(extracellular matrix， ECM)；此外，分泌轉化生長因子β1(fibroblast growth factor-2，TGF-β1)和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factors，PDGFs)來活化成纖維細胞和間充質細胞以及募集和活化中性粒細胞和巨噬細胞。血小板缺陷與傷口愈合延遲相關，提供自體高濃度血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)可促進傷口愈合[1, 2]。

1.中性粒細胞:創傷早期中性粒細胞是第一個被募集到受傷組織的免疫細胞，在發生凋亡之前存留約24h，在殺死微生物和促進傷口愈合方面起著重要作用。中性粒細胞分泌多種抗菌物質：活性氧(reactive oxygen species，ROS)，抗菌肽和抗菌蛋白酶，在中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)的幫助下吞噬入侵病原體[3]；中性粒細胞還分泌包括IL-17和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的多種細胞因子和生長因子，這些因子趨化炎性細胞并促進成纖維細胞，角質形成細胞和內皮細胞的增殖[4]。中性粒細胞完成清除功能后發生凋亡，隨后被巨噬細胞清除。C-X-C基序趨化因子受體2(C-X-C motif chemokine receptor 2，CXCR2)是中性粒細胞趨化性的重要介質，結合傷口部位的角質形成細胞釋放的大量趨化因子配體發揮作用，包括C-X-C趨化因子配體(C-X-C chemokine ligand，CXCL)-1、-5和-8。在傷口愈合的早期階段，CXCR2敲除小鼠可干擾中性粒細胞的募集導致傷口愈合延遲，然而也表現出單核細胞浸潤時間改變，IL-1β分泌減少，角質形成細胞遷移和增殖減少，因此傷口愈合延遲可能是許多因素復合的結果[5]。另一項研究發現耗竭小鼠的中性粒細胞加速了傷口閉合和再上皮化，因此中性粒細胞在皮膚修復過程中的作用相對復雜[6]。

2.巨噬細胞：單核細胞來源的巨噬細胞已在傷口愈合領域得到廣泛研究，被認為是該過程中最重要的免疫細胞。中性粒細胞凋亡過程中釋放細胞因子可趨化單核細胞，其在損傷后5～6h開始出現并分化為巨噬細胞，可在傷口部位存留數周。此外大多數組織中定居的巨噬細胞在受傷后增殖，然而小鼠傷口模型證實這些巨噬細胞對傷口愈合時間或組織完整性幾乎沒有影響，在皮膚傷口愈合中的作用仍然難以捉摸[7]。

巨噬細胞在整個愈合過程中經歷表型變化，這有助于傷口微環境從促炎癥轉變為促修復狀態，最常研究的表型是M1型(即經典活化的巨噬細胞)和M2型(即選擇性活化的巨噬細胞)[8]。這種M1和M2分類起源于細胞的體外表征，但最近提出了一種改進的分類系統，將巨噬細胞亞群與激活途徑聯系起來，例如M(IFN-γ)、M(IL-4)等[9]。然而，目前很難知道哪種途徑可以在體內激活巨噬細胞。

巨噬細胞對于正常的傷口愈合至關重要。在初始浸潤時，促炎巨噬細胞(M1)去除細胞碎片、受損的基質、微生物和中性粒細胞；分泌IL-1、成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)、PDGF和VEGF等促炎細胞因子和生長因子，動員更多的免疫細胞，并促進角質形成細胞、成纖維細胞和上皮細胞的增殖。在組織新生階段，微環境觸發巨噬細胞轉變為抗炎表型(M2)，M2分泌TGF-β1等抗炎細胞因子促進ECM合成和傷口收縮。在最后階段，抗炎巨噬細胞幫助ECM重組和吞噬殘留的碎片。Lucas等[10]使用組織修復各個階段巨噬細胞耗竭的小鼠證明了其重要性。早期巨噬細胞耗竭顯著減少肉芽組織形成，上皮化受損和減少瘢痕形成。中期階段巨噬細胞耗竭導致嚴重出血，而晚期耗竭并未顯著影響愈合的結局。此外，抗炎巨噬細胞通過降解ECM形成管腔來引導內皮細胞增殖和遷移，并釋放FGF和胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)等血管生成因子，從而間接促進血管生成[11]。

3.T淋巴細胞:T淋巴細胞(T細胞)對炎癥消退和組織重塑也至關重要。在炎癥階段，巨噬細胞分泌干擾素-γ(interferon gamma，IFN-γ)等趨化因子，吸引T細胞到達傷口。IFN-γ還促進CD4+T輔助細胞1型(TH1)極化，這有助于傷口最初的促炎微環境。組織定居的γδT細胞也調節皮膚傷口愈合，其通過分泌FGF-7、FGF-10和胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)等生長因子來調節角質形成細胞的增殖和分化。γδT細胞缺陷小鼠由于角質形成細胞增殖減少導致皮膚發育缺陷[12]。調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)在維持皮膚穩態中也起著重要作用[13]。Tregs分泌精氨酸酶和抗炎細胞因子(IL-10和TGF-β1)，促進抗炎巨噬細胞極化并抑制炎性反應，Tregs和TH2細胞也通過分泌IL-4、IL-5、IL-13和IL-21促進基質形成。研究表明IL-4刺激膠原蛋白合成的效力幾乎是TGF-β的兩倍。Treg耗竭小鼠與野生型比較傷口愈合變慢[14]。與此相反，自然殺傷T細胞(natural killer T cells，NKT)對傷口愈合具有抑制作用。小鼠NKT細胞耗竭會提高傷口愈合率[15]。

4.肥大細胞：肥大細胞在受傷后立即釋放組胺和VEGF等分子，并增加血管通透性。組胺在血管中形成孔道，促進蛋白質和白細胞外滲到傷口部位。肥大細胞也釋放抗菌肽(導管素)來輔助抗感染。此外，肥大細胞在增殖期刺激內皮細胞，角質形成細胞和成纖維細胞增殖并影響膠原的產生和重塑。

5.成纖維細胞：增殖期主要進行血管和肉芽組織生成，表皮細胞再生以及ECM生成。不同來源的成纖維細胞遷移形成肉芽組織，成纖維細胞重新填充傷口中的組織缺損并提供新的ECM。生成的ECM用作支架，成纖維細胞和其他細胞在其上遷移到創面。一旦形成肉芽組織，成纖維細胞產生加量的膠原蛋白，用于增強傷口永久ECM的拉伸強度。成纖維細胞還能對炎性分子、病原體、機械性質和氧水平的變化等信號發生應答；可產生許多細胞因子，趨化因子和生長因子來應對不斷變化的傷口環境。成纖維細胞積極參與新的組織發育和傷口愈合的調節。一些成纖維細胞在增殖期通過TGF-β分化為肌成纖維細胞。促進傷口收縮并最終發生凋亡的肌成纖維細胞隨后被引發組織重塑的第二波成纖維細胞取代。

6.內皮細胞：內皮細胞血管新生是創面修復生肌過程中的關鍵環節之一。傷口早期血管化包括內皮細胞增生和遷移之后形成毛細血管以出芽方式向創面基地床生長，這對支持再生組織至關重要。具有新生血管的基質形成和重塑過程很大程度上取決于巨噬細胞，Tregs和TH2細胞。抗炎巨噬細胞分泌TGF-β、PDGF、FGF-2、IGF-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和VEGF促進基質沉積和血管生成。TGF-β刺激間充質細胞分化肌成纖維細胞直接促進ECM合成。TGF-β和PDGF觸發成纖維細胞和肌成纖維細胞產生新ECM。血小板、巨噬細胞、表皮細胞和活化的成纖維細胞分泌VEGF和FGF2招募內皮細胞進入傷口形成新血管來重建血液供應。

7.角質形成細胞：表皮修復從傷口的邊緣開始，需要角質形成細胞遷移和增殖來覆蓋新生的肉芽組織，這個過程稱為再上皮化。角質形成細胞在損傷后經歷表型變化，而且表皮和基膜之間的接觸喪失，伴隨大量蛋白酶的分泌從而使表皮細胞橫向移動進入傷口。一旦基膜和下面的真皮恢復，角質形成細胞就會恢復正常表型。巨噬細胞、肌成纖維細胞和新生血管通過釋放生長因子來促進角質形成細胞增殖和重新上皮化。

重塑階段的特點是ECM的活躍重組和毛細血管總數的減少。傷口愈合的早期由成纖維細胞產生的Ⅲ型膠原主要被Ⅰ型膠原取代，其通過增加膠原纖維之間的交聯數而成熟。隨著生長因子的持續存在、肉芽組織的形成和基質的沉積，皮膚缺損可以通過大量的細胞性和纖維性瘢痕組織暫時修復，這種生理性纖維化為新形成的組織提供抗張強度。 在重塑過程中傷口抗張強度增加，但完全愈合的傷口只能達到未損傷組織的70%。膠原蛋白的收縮和隨后的異常沉積導致形成缺乏真皮細胞的纖維性瘢痕。抗纖維化巨噬細胞釋放基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)(MMP-2、-12和-19)，產生對改善局部組織完整性至關重要的Ⅷ型膠原蛋白。結果細胞增殖和蛋白質合成減少，并且ECM被重塑成沿張力線的較大原纖維。最終大多數內皮細胞、巨噬細胞和肌成纖維細胞退出傷口或發生細胞凋亡，新生的毛細血管由于營養需求減少開始退化。根據初始傷口的大小，整個過程通常會形成小傷疤[16]。

二、慢性創面

慢性創面是創面正常的愈合順序被破壞，盡管進行了適當的治療，但愈合過程延長。最常見的慢性創面包括靜脈或動脈潰瘍，壓瘡或糖尿病性潰瘍。導致創面發展為慢性的主要因素包括持續存在的炎癥階段、高酶活性、修復細胞增殖障礙、細胞衰老、細菌感染、氧合作用減少和營養缺乏等。雖然傷口愈合級聯在急性傷口中協調良好，但慢性傷口無法超越炎癥階段，阻止了細胞增殖和基質沉積，最終導致傷口遷延不愈。

1.中性粒細胞：中性粒細胞活性過高、凋亡失調和NETs過量都可能導致難愈合性傷口。傷口部位過多的中性粒細胞導致ROS過量產生，導致ECM和細胞膜受損，引起細胞早衰。ROS還會激活蛋白酶(MMPs和絲氨酸蛋白酶)和滅活蛋白酶抑制劑，導致蛋白水解增加并進一步加劇ECM降解。中性粒細胞釋放的蛋白酶能夠降解PDGF和TGF-β1等關鍵的生長因子。由于中性粒細胞被大量募集到傷口部位并通過有毒化合物加劇了促炎性微環境和細胞因子分泌，其凋亡對炎癥消退至關重要。糖尿病小鼠的慢性傷口有更多的凋亡細胞，其中大部分是中性粒細胞，導致炎癥階段延長[17]。糖尿病小鼠慢性傷口中分離的中性粒細胞在應對金黃色葡萄球菌感染時持續分泌TNF-α，較少發生細胞凋亡[18]。這種差異可能是由于前面研究中糖尿病傷口募集的中性粒細胞總體增多或缺乏細菌感染所致。然而，在這兩種情況下，中性粒細胞凋亡失調促成慢性傷口狀態。最新研究表明糖尿病激活了中性粒細胞發生NETosis，NETs過多或持續存在導致創面愈合遲緩[19]。臨床研究發現難愈合性糖尿病足患者NETs組分明顯升高。傷口的高濃度彈性蛋白酶與感染密切相關并隨后引起潰瘍加重。高濃度的 NE 降解創面基質導致愈合遲緩，NETs 和組蛋白可直接導致上皮細胞和內皮細胞損傷。DFU患者血液中NETs組分(彈性蛋白酶、組蛋白、NGAL、蛋白酶3)明顯升高，血液中彈性蛋白酶和蛋白酶3與感染有關，血清彈性蛋白酶水平可預測傷口愈合遲緩。研究發現：1型和2型糖尿患者和小鼠的中性粒細胞都被激活并產生NETs、PAD4水平升高。糖尿病小鼠與正常小鼠比較，其創面瓜氨酸化的H3升高(H3Cit、NET標志之一)，并且創面愈合延遲[20, 21]。

2.巨噬細胞：傷口局部巨噬細胞浸潤增多、 從促炎到抗炎的表型轉化和胞葬功能異常會擾亂正常的傷口愈合過程，從而導致難愈合性傷口[22]。慢性傷口中過多的中性粒細胞和巨噬細胞導致愈合過程的破壞，包括細胞反應的變化，ROS的過度產生和形成以異常生長因子譜、蛋白水解失衡和炎癥狀態的延長和增強為特征的難愈合的微環境。免疫細胞呼吸爆發尤其是NADPH-氧化酶(NOX)酶活性增加引起的過量ROS生成。ROS過量會干擾氧化劑/抗氧化劑的平衡；這不僅增強了調節促炎細胞因子/趨化因子(IL-1、IL-6和TNF-α)和MMPs分泌的信號通路，而且還造成成纖維細胞衰老。衰老的成纖維細胞產生高水平的蛋白酶(MMP-2、3和9)以及較少的蛋白酶抑制劑，進一步促使傷口慢性化。巨噬細胞的極化在急性傷口愈合中受到高度調節，其中斷導致了傷口慢性化。 例如使用鐵來誘導不完全的巨噬細胞表型轉化會損害人和小鼠的創面愈合。在這些研究中傷口邊緣80%的巨噬細胞具有促炎表型，導致了創面持續存在。糖尿病小鼠模型也表明，當巨噬細胞沒有經過適當的表型轉換，會導致進展到增殖期必需的生長因子(TGF-β1、VEGF和IGF-1)的減少[23]。 促炎性巨噬細胞還分泌炎性介質，如TNF-α、IL-17和IL-1b，ROS和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，它們高濃度時對傷口微環境有負作用。過量的TNF-α導致MMP-1和MMP-3的分泌增加，TIMP-1分泌減少，從而過多ECM蛋白被水解直接導致傷口慢性化。巨噬細胞除在吞噬傷口床中的凋亡細胞和其他碎片中也起關鍵作用。由于中性粒細胞的浸潤和凋亡增加，巨噬細胞的胞葬作用在慢性傷口尤為關鍵。然而在慢性傷口中，巨噬細胞表現出吞噬能力降低，加劇了凋亡細胞的負擔。此外，胞葬功能異常導致促炎：抗炎細胞因子比例增高，進一步損害糖尿病傷口的愈合。

3.成纖維細胞：慢性傷口的大多數成纖維細胞過早衰老，形態異常以及遷移和由p38-MAPK通路上調引起增殖能力下降。此外，慢性傷口間隙連接蛋白43(connexin 43, Cx43)含量升高，破壞了成纖維細胞遷移，導致傷口閉合延遲和更大的瘢痕。此外，在慢性而非急性傷口中觀察到更多的脂肪組織，也限制了成纖維細胞的遷移。慢性創面中成纖維細胞對生長因子無反應；信號級聯中的生長因子及其受體和下游組分的數量減少。慢性傷口MMPs活性增強進行肽片段化是生長因子信號轉導和成纖維細胞反應性降低的原因之一。因此，盡管生長因子通常在慢性傷口生成增多，但可用性較低。此外金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)水平降低也導致創面慢性化。衰老成纖維細胞分泌蛋白質譜和正常成纖維細胞不同，例如促炎細胞因子和Ⅲ型膠原水平升高，Ⅰ型膠原和纖維連接蛋白水平降低，導致創面不易愈合[24]。

4.血管內皮細胞:大量實驗已證明慢性皮膚潰瘍的核心問題之一是局部血運不良，創面愈合血管化延遲，病理特點是創面細胞增殖分化水平低，不形成或很少形成肉芽組織。研究表明，糖尿病慢性創面血管再生受到抑制，肉芽組織生成減少，創面愈合緩慢。microRNA(miRNA) 是調控血管再生功能的主開關。miR-200b是血管新生的開關，損傷可降低其表達。糖尿病小鼠創面炎性反應持續存在，長期大量表達TNF-α。體外實驗證實大劑量TNF-α刺激HDEMC可導致miRNA200b升高，GATA2 和 VEGFR2下調，管腔形成受到抑制[25,26]。VEGF是目前所知最重要的生理和病理狀態下血管新生的調節因素，可刺激血管內皮細胞分裂增殖從而增加微血管新生，又可提高血管通透性從而促進創面的生長愈合。VEGF主要由角質細胞、巨噬細胞分泌，通過與內皮細胞表面的特異性膜受體結合，激活受體內的酪氨酸激酶，引起一系列的信號轉導，導致內皮細胞增生。VEGFR-2是血管系統形成最早的標志。在皮膚創傷愈合過程中，尤其在肉芽組織形成期，VEGF/VEGFR-2所介導的信號通路可以調控血管內皮細胞增生、遷移、存活和通透性，從而促進血管新生。正常組織中VEGFR一般呈低表達，但創傷過程中VEGFR表達可上調。

5.適應性免疫細胞:目前對適應性免疫系統在慢性傷口中的作用知之甚少。目前已知糖尿病足潰瘍患者表皮中朗格漢斯細胞(LC)數量的增加可促進傷口愈合。 在人類離體模型中，與非愈合糖尿病足潰瘍(DFU)比較，可愈合DFU已經發現更多數量的朗格漢斯細胞(早期傷口愈合中的樹突狀細胞亞型)。組織損傷后LC的主要作用之一是激活和募集T細胞。有趣的是，慢性傷口中的T淋巴細胞也較少，而那些存在的T淋巴細胞表現出無反應，功能受損的狀態。實際上，即使用佛波酯(PMA)和離子霉素刺激后，人類慢性傷口分離的γδT和αβ T細胞也不能分泌IGF-1和IL-2。與急性傷口比較，慢性傷口的 CD4 T和CD8 T細胞浸潤延長和比例不同，但耗盡CD4和CD8 T細胞似乎不會影響小鼠傷口愈合率[27]。

傷口愈合是個復雜的過程，多種重要的免疫細胞和免疫分子參與其中，通過對其機制的深入研究可指導臨床靶向治療來促進創面修復。