細胞外基質在皮膚組織創面修復中的研究進展

劉青武 何秀娟 張金超 林 燕 李 萍

人類皮膚細胞外基質(extracellular matrix, ECM)是由細胞合成并分泌到細胞外，分布在細胞表面或細胞之間的大分子物質，主要是水、蛋白質、蛋白聚糖和多糖。ECM支持并連接組織結構，調節組織的生長和細胞的生理活動，其在機體發育、組織動態平衡及創面修復中起著重要作用。為便于了解ECM用于皮膚創面修復治療的研究現狀，現將近年研究進展綜述如下。

一、ECM的結構和作用

1.ECM的結構:ECM是由纖維蛋白和基質所構成的復雜三維網狀結構，纖維蛋白主要有膠原蛋白、彈性蛋白和纖維粘連蛋白，膠原蛋白是細胞外基質中主要的蛋白質，Ⅰ～Ⅲ型膠原蛋白含量最豐富，Ⅰ型膠原具有很強的抗張強度，Ⅱ型膠原主要分布于軟骨中，Ⅲ型膠原形成細微的膠原纖維網，廣泛分布于疏松結締組織。纖維蛋白將細胞粘連在一起構成組織，并提供細胞外網架，維持細胞形態。而基質成分主要包括蛋白聚糖和糖胺聚糖，在纖維蛋白的周圍形成凝膠狀物質，參與細胞間及細胞與ECM的相互作用，對細胞活性有一定影響[1]。

2.ECM的作用:皮膚作為機體屏障的能力，主要由維持皮膚連續性和完整性并在受傷后修復皮膚的細胞決定。皮膚修復依賴于多種細胞信號轉導及細胞的功能活動，涉及多種調節，包括生長因子、細胞因子、基質金屬蛋白酶、細胞受體和ECM成分等。ECM作為皮膚細胞生存的微環境，不僅對組織細胞起支持保護和營養作用，還與細胞的增殖、分化、代謝、識別、黏著及遷移等基本生命活動密切相關。ECM影響著干細胞/祖細胞的細胞極性、屏障功能及其微環境，以適應細胞間通訊、細胞遷移等不同需求。ECM組分中的蛋白質家族可以相互作用，比如，纖維粘連蛋白具有與其他蛋白質結合的位點，而誘導細胞內信號通路及細胞功能的改變。在急性皮膚創傷時，膠原蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖取代臨時ECM，參與肉芽組織的形成，大量ECM的聚集，刺激表皮細胞遷移，促進傷口再表皮化[2]。ECM的組分可調節生長因子的釋放、血管再生、組織病理改變和炎性應答等，對于機體修復和再生有非常重要的作用，是決定修復質量的關鍵因素之一。

在廣泛的燒傷及其他全層皮膚傷口中，如糖尿病潰瘍、嚴重燒傷和莫氏手術治療惡性腫瘤等，往往涉及皮膚移植，比如自體、同種異體、異種皮膚移植物等。但由于自體皮膚有限，移植后產生繼發缺損、瘢痕，異體移植物免疫反應以及各種疾病風險等缺陷，引起了臨床對更先進皮膚替代品的需求。ECM可來源于人體、動物(牛、豬等)、植物等，這些材料被稱為生物支架[3]。隨著基因工程、組織工程的迅速發展，利用基因技術、組織工程皮膚技術將ECM用于修復全層皮膚創口，已經成為創傷領域的研究熱點。

二、脫細胞組織或器官來源的ECM

脫細胞組織或器官來源的ECM的機械結構及生物功能，與天然組織非常相似，而脫細胞的目的就是去除潛在的免疫應答的細胞組分，為宿主細胞和血管的生長，提供良好生物相容性的生物支架[4]。因此，脫細胞生物材料可更好的刺激局部環境修復組織，無需基于細胞療法的監管和科學挑戰。目前組織或器官脫細胞的方法包括化學法、酶法和機械法，化學法是用表面活性劑或酸堿破壞細胞形態而去細胞，機械法通過凍融、超臨界二氧化碳或提供高靜水壓的方式使組織細胞膨脹破裂，留下基本上由ECM成分組成的材料[5]。不同的脫細胞方法決定了ECM保留成分及數量的不同，影響ECM的生物學活性。但普通化學法、酶法和機械法脫細胞的方法存在著遺傳物質(DNA)去除不完全或ECM成分損失或生物活性受損等缺點[6]。郭寶林等[7]使用磷脂酶A2-脫氧膽酸鈉(phospholipase A2-sodium deoxycholate，PLA2-SDC)復合脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)、核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)的去細胞方法，制備的ECM無遺傳物質保留，而且膠原、膠原層連蛋白和纖連蛋白等保存良好，該方法的優點是操作時間短，ECM成分暴露時間短，對ECM的生物活性影響小，這種改良的酶脫細胞法為ECM支架的提取提供了新的思路。

1.人胎盤來源的ECM:人胎盤含有豐富的ECM成分和保存完好的多種內源性生長因子，如胰島素樣生長因子-1、表皮生長因子、血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子-2、血管內皮生長因子和轉化生長因子-β等，這些細胞因子通過胎盤傳遞給胎兒，在促進胎兒發育中起重要作用。此外，胎盤的抗炎、抗菌、低免疫原性、抗痙攣和傷口保護等生物學特性，使其成為治療燒傷皮膚、腿部潰瘍和眼科疾病的理想材料。

Choi等[8]利用人胎盤制造多孔的脫細胞ECM片，其中含有來自胎盤的各種保存完好的蛋白質和生物活性分子，并將其用于治療兔全層皮膚傷口。在早期階段，ECM片有效地吸收傷口滲出物，并緊密附著在傷口表面。植入后數周，傷口完全閉合，表皮細胞排列整齊，表皮和真皮的雙層結構恢復，并形成新的毛囊和微血管。總體而言，ECM片是具有與正常皮膚組織相似的真皮替代物，人胎盤衍生的ECM片提供有利于細胞生長和分化的微環境，從而促進全層傷口的愈合。Rameshbabu等[9]在胎盤ECM中加入絲素蛋白，改進其機械性能，制成的多孔復合ECM海綿。在體外實驗中，多孔復合ECM海綿能促進人包皮成纖維細胞、人表皮角質形成細胞和人羊膜來源的干細胞的黏附、滲透、增殖和遷移。此外，在大鼠全層傷口模型中植入多孔復合ECM海綿，明顯的促進血管生成，增強肉芽組織形成和早期再上皮化，改善表皮-真皮連接的愈合。另外，皮下植入的多孔復合ECM海綿，對宿主沒有嚴重的免疫應答。說明具有優異物理機械性質和細胞因子裝飾的多孔復合ECM海綿，可以是全厚度皮膚傷口的合適皮膚替代物。

2.膽囊來源ECM：膽囊細胞來源的ECM是一種新型的無細胞蛋白質可降解生物材料，該基質富含膠原蛋白。膽囊源性ECM被證明可用于胃腸切除術和吻合術，還具有類似于心臟瓣膜的微結構，支持瓣膜內皮細胞和間質細胞的增殖。

Poonam等[10]從豬膽囊中提取了膽囊源性ECM，并比較了其與市售膠原片，在大鼠全厚皮膚創面的愈合潛力，發現膽囊源性ECM通過增加切除傷口中的細胞增殖、新血管形成、膠原合成及上皮形成，增強傷口愈合活性，對大鼠全層皮膚創傷的修復效果優于市售膠原片。Shakya等[11]使用陰離子生物洗滌劑制備源自牛脫細胞膽囊ECM，并發現牛脫細胞膽囊ECM比空白組創面更顯著的促進傷口收縮、促進表皮及新血管、纖維組織的增生，再次證明膽囊源性ECM具有修復全層皮膚傷口的潛力。

3.豬皮來源ECM：郭寶林等[7]將脫細胞豬皮ECM用于小鼠全層皮膚損傷模型，經組織學檢查發現生理鹽水組小鼠第28天時，創口愈合，而豬皮ECM創口在14天時愈合，豬皮ECM組創傷愈合速度有顯著提高。證實了ECM在創傷愈合中的促進作用，脫細胞豬皮ECM也可以作為一種良好的皮膚支架材料。

4.綿羊膀胱來源ECM：Zihayat等[12]從綿羊膀胱中提取ECM，觀察了綿羊膀胱ECM在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠創面愈合中的作用，并與外用凡士林及對照組比較，ECM處理的動物創面面積和創面愈合率均有顯著改善(P<0.01)，ECM處理的傷口上皮化得更快。這與綿羊膀胱ECM所含的透明質酸(HA)、膠原蛋白、彈性蛋白和生長因子，增加了角質形成細胞的增殖和遷移而促進再上皮化有關，但需要進一步的研究來闡明ECM傷口愈合的確切機制。

5.胎牛來源ECM：Neill等[3]用胎牛膠原(bovine fetal collagen，BFC)治療9例難愈性全層皮膚傷口的患者，并觀察了植入BFC后取得的活檢標本中BFC的生物反應。結果在植入2周后，BFC中見成纖維維細胞增生、新血管形成及疏松的嗜酸、淋巴細胞浸潤，未見中性粒細胞。隨著植入時間的增長，在27天時，BFC中的成纖維細胞數量明顯增多。患者移植BFC治療時間最長的是9個月，BFC的膠原結構已經與正常膠原類似，移植區域未見明顯瘢痕。但與其他患者不同的是，來自1例患有凝血功能障礙的肝衰竭患者的移植物，由于受患者機體環境的影響，在20天時可見急性炎性反應。說明BFC在大多數情況下，對宿主的組織耐受性較好，允許炎性細胞的遷移，支持肉芽組織的形成，有助于慢性傷口的愈合，但宿主和傷口因素也可能通過尚不清楚的機制導致BFC的功能障礙。所以，Neill等[3]建議在臨床使用BFC時，BFC組織學的特征應當由參與患者創面治療的病理學專家評定。

三、ECM作為干細胞載體

干細胞療法提供了一種有希望的新技術來促進傷口愈合，但干細胞移植后，常常出現死亡或從傷口部位遷移，大大降低了治療效果。而局部應用具有抗氧化作用的化合物，可顯著改善傷口愈合過程并保護組織免受氧化損傷。脫細胞ECM可能是一種抗氧化治療方法，可以預防移植的間充質干細胞的氧化損傷，對傷口愈合具有良好的效果[13]。

豬小腸黏膜下層細胞外基質作為一種運載工具，具有天然的ECM成分，包括其膠原纖維網絡，可為干細胞提供了合適的生存環境。Lam等[14]使用源自豬小腸黏膜下層的ECM貼片材料將脂肪來源的干細胞引入小鼠皮膚切口。并使用生物發光體內成像所證實，單獨移植至皮膚傷口的干細胞在移植后不能存活，相反，使用貼片進行遞送，則使干細胞增殖和存活顯著增加，并且與未治療的傷口比較，在貼片上用干細胞處理的傷口中纖維化的區域(表明瘢痕形成)顯著減少。由于貼片是一種非侵入性地提供干細胞治療的方法，可以進一步嘗試與各種干細胞聯合治療其他類型的傷口。

四、ECM水凝膠

人類脂肪組織來源豐富，并含有豐富的ECM蛋白和可溶性生長因子，故常用作ECM來源。

Kim等[15]報告了基于人脂肪來源的可溶性ECM(soluble ECM, sECM)和甲基纖維素(methylcellulose, MC)形成的熱敏水凝膠，可通過注射以遞送干細胞。將提取的sECM與MC混合，可以改善熱敏水凝膠的機械性能。sECM-MC水凝膠的特征在于sECM含量、流變性質和嵌入干細胞的能力。在小鼠全厚皮膚傷口中單次注射干細胞水凝膠后，傷口通過重新上皮化和新生血管化而迅速愈合，瘢痕形成最小。表明sECM-MC水凝膠是一種很有前途的干細胞遞送和組織再生的可注射載體，代表了水凝膠可以作為一種新型的生物支架方法。Zhu等[16]通過將透明質酸和羧化殼聚糖加入到人類膠原中制成水凝膠制劑，發現水凝膠促進了小鼠成纖維細胞的黏附、增殖和遷移，有利于促進傷口愈合。其表現出良好的皮膚修復、藥物遞送的潛力。但關于水凝膠刺激傷口愈合的機制，仍需要進一步研究。

五、大豆蛋白/纖維素納米纖維支架仿制的皮膚ECM

模擬ECM的生物支架，具有能夠支持參與再生的細胞生長的生物活性分子。大豆蛋白是從大豆中提取的一種膳食蛋白，具有類似于人體組織ECM蛋白的生物活性肽，這些ECM模擬肽可以促進細胞黏附、增殖和遷移，支持組織再生。大豆蛋白含有植物雌激素，可作為雌性激素的結構和功能類似物。大豆蛋白中的生物活性肽可增加皮膚ECM合成，促進創面再上皮化[17]。大豆植物雌激素通過雌激素受體介導的信號通路，加速愈合過程，它還具有抗細菌、抗炎和抗氧化特性。大豆蛋白質和植物雌激素的口服攝入，可加速老年女性和燒傷患者的皮膚再生[18]。

Ahn等[19]利用旋轉噴射紡絲技術，開發一種由醋酸纖維素(cellulose acetate, CA)和大豆蛋白水解物(soy protein hydrolysate, SPH)組成的完全植物納米纖維敷料。紡絲納米纖維成功地模擬了天然皮膚ECM的理化性質，并表現出高保水性能。由于其非動物來源，可避免動物源性蛋白的免疫原性、疾病傳播和病原體污染等缺點。體外實驗表明，與聚己內酯和CA納米纖維比較，CA/SPH納米纖維可促進成纖維細胞的增殖、生長、遷移、浸潤和整合素β1的表達，并表現出低細胞毒性。在體內，CA/SPH納米纖維比CA納米纖維或未處理的對照組比較，能加速傷口愈合和組織再生，并以類似于其他纖維支架的方式減少瘢痕形成。這些結果證實了CA/SPH納米纖維作為一種新型傷口敷料的愈合潛力，來源于植物基質的可再生支架可能成為下一代可再生敷料的研究方向。

六、其 他

1.胎盤生長因子(PIGF-2)序列：生長因子是一類通過與細胞膜受體結合，調節細胞生長和功能的多肽類物質。通過增強生長因子與細胞外基質的結合，可促進創傷愈合。

Martino等[20]發現了位于胎盤生長因子(placental growth factor, PIGF-2)上的一個包含22個氨基酸的區域，能增強PIGF-2與ECM蛋白質的結合力。Martino將該結構域與血管內皮生長因子-A、血小板衍生生長因子-BB和骨形態發生蛋白-2融合而成的工程化生長因子對比未經修飾的生長因子顯示出了更強的ECM親和力，更快的促進了新血管形成和肉芽組織的生長，促進傷口愈合，從而大大提高了生長因子對組織損傷修復的能力。

2.縫隙連接蛋白43(connexin, Cx43):縫隙連接在1967年首次在肝細胞中被描述。目前，在人和嚙齒動物皮膚中已經鑒定出多達10個不同的連接蛋白家族成員。用Cx43反義寡脫氧核苷酸處理的受傷和燒傷的小鼠皮膚表現出加速的傷口愈合，增強的角質形成細胞增殖以及成纖維細胞的遷移增加和更顯著的膠原沉積，這提示抑制連接蛋白信號轉導是能促進創傷愈合的[21]。Cogliati等[22]利用雜合子Cx43敲除小鼠，發現Cx43缺乏可促進真皮成纖維細胞的增殖和活化，從而促進再上皮化和創面愈合，促進細胞外基質重塑因子的表達。這些數據再次證實了Cx43在皮膚創傷愈合中可能是一個新的治療靶點。

綜上所述，ECM含有多種有益于細胞增殖的成分，在皮膚創面修復過程中具有重要作用，目前通過基因工程，特別是組織工程皮膚技術，已能夠將同種、異種或植物成分ECM用于人或動物的創面修復，并顯示了較好的修復效果。但是，關于ECM修復人的皮膚創面的研究仍較少，需要廣大研究者深入探索。