反義寡核苷酸治療的分子影像技術(shù)進(jìn)展

孔繁磊,劉思耘,張寶平,石 喻，趙相軒，趙周社,郭啟勇※

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽 110004； 2.GE醫(yī)療系統(tǒng)集團(tuán)(中國)，北京100176)

1998年RNA干擾(RNA interference,RNAi)作用被提出后[1]，RNAi憑借其幾乎可以沉默任何選定基因的潛能，使基因治療向前跨越了一大步。小干擾RNA(small interfering RNAs,siRNA)是一種雙鏈RNA分子，長度一般為21～23個核苷酸。在進(jìn)入細(xì)胞后，siRNA依靠ATP供能，與一種被稱為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的多亞基蛋白結(jié)合，在RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體攜帶下與其序列互補(bǔ)的信使RNA(messenger RNA,mRNA)相結(jié)合，抑制特定序列mRNA翻譯或在核酸內(nèi)切酶及核酸外切酶的作用下降解掉與其序列互補(bǔ)的mRNA片段，從而抑制特定基因的表達(dá)，這種基因治療方式稱為RNAi治療或反義寡核苷酸治療。

反義寡核苷酸治療在許多疾病的治療中具有巨大的潛力，目前研究主要集中在眼類疾病、病毒感染、炎性疾病、基因紊亂和腫瘤[2-5]。但反義寡核苷酸治療藥物在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至靶點(diǎn)發(fā)揮作用過程中也面臨許多障礙[6-7]，并且由于一些不可預(yù)期的不良反應(yīng)，反義寡核苷酸治療還面臨著安全方面的考量[4,8-9]。目前包括光學(xué)成像、磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、單光子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像(singlephoton emission computed tomography,SPECT)、正電子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像(positron emission tomography,PET)及超聲成像等多種分子影像模式已經(jīng)應(yīng)用在反義寡核苷酸治療相關(guān)的研究上，用于對反義寡核苷酸治療的生物進(jìn)程進(jìn)行成像、描繪和定量，并對反義寡核苷酸治療效果進(jìn)行監(jiān)測，幫助研究者進(jìn)一步理解RNAi生物學(xué)進(jìn)程和沉默機(jī)制，優(yōu)化反義核苷酸治療[10]。現(xiàn)就多種用于反義寡核苷酸治療的分子影像技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在促進(jìn)分子影像在反義寡核苷酸治療方面的應(yīng)用和臨床轉(zhuǎn)化。

1 光學(xué)顯像

光學(xué)顯像主要包括熒光顯像和生物發(fā)光顯像(bioluminescence imaging,BLI)。由于光學(xué)顯像具有光學(xué)標(biāo)記選擇多、易于標(biāo)記、無創(chuàng)、可多通道功能成像及全身實(shí)時顯像優(yōu)勢，為反義寡核苷酸治療的臨床前期研究提供了最便捷的成像方法。并且光學(xué)顯像憑借其出色的敏感性及低廉的價格成為小動物實(shí)驗(yàn)中實(shí)時監(jiān)測siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的重要成像方法。

1.1熒光顯像 在熒光成像中，小動物被特定波長的光照射，激發(fā)其原位標(biāo)記的熒光顯像劑，然后熒光顯像劑發(fā)射的光被低溫電耦合元件過濾和檢測。由于激發(fā)和發(fā)射的光都是可見波波段的低能光子，相對于具有電離輻射的其他成像方法，其顯像更安全。然而，同樣也是因?yàn)榭梢姽夤庾幽芰枯^低，組織成分的吸收也造成了熒光顯像組織穿透性不足這一弊端，使其在實(shí)際應(yīng)用中不能用于大型動物或人的深層組織顯像。此外，由于光在組織中傳播存在散射現(xiàn)象，易造成熒光圖像模糊，且在活體光學(xué)顯像實(shí)驗(yàn)中，存在著由天然的組織熒光團(tuán)所發(fā)射的自體熒光，這些熒光信號可以覆蓋熒光探針的信號，最終降低圖像的信噪比[11]。因此，在反義寡核苷酸治療的熒光活體成像研究中多采用近紅外熒光。波長650～900 nm的近紅外熒光有較深的組織穿透性，同時具有較少的組織吸收、散射和自體熒光干擾[12]。如由菁熒光染料5.5(cyanines dye 5.5,Cy5.5)標(biāo)記的血管內(nèi)皮生長因子siRNA與聚乙二醇通過二硫化合物連接，并與聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)形成微膠粒。通過觀察Cy5.5可以了解載有血管內(nèi)皮生長因子siRNA的微膠粒將siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入前列腺癌細(xì)胞的過程。前列腺癌荷瘤小鼠注射此類微膠粒后，可以觀察到Cy5.5標(biāo)記的siRNA微膠粒在腫瘤和主要器官中的聚集[13]。除組織熒光染料外，量子點(diǎn)、碳點(diǎn)[14-15]、上轉(zhuǎn)換納米微粒等納米材料由于具有較高的信號強(qiáng)度和良好的光穩(wěn)定性，也可同樣用于反義寡核苷酸治療的光學(xué)成像。特別是腫瘤特異性的多功能siRNA-量子點(diǎn)復(fù)合物，一方面可以誘導(dǎo)表皮生長因子Ⅲ表達(dá)下調(diào)，這種效應(yīng)可以干擾多種腫瘤細(xì)胞增殖；另一方面，腫瘤細(xì)胞對siRNA-量子點(diǎn)復(fù)合物的攝取可用于熒光顯像[16]。與量子點(diǎn)相比，碳點(diǎn)有更好的生物兼容性、價格低廉且更容易制備，被認(rèn)為是量子點(diǎn)良好的替代品。近年來，上轉(zhuǎn)換納米微粒作為新一代的生物冷光納米探針在細(xì)胞的標(biāo)記和光學(xué)顯像方面得到了越來越多的關(guān)注。上轉(zhuǎn)換納米微粒具有穿透力強(qiáng)、低自發(fā)光背景、強(qiáng)抗光漂白等優(yōu)勢，憑借這些優(yōu)勢成為反義寡核苷酸治療方面非常具有前景的光學(xué)顯像方式[17]。

1.2BLI 相比于熒光成像，BLI不需要為活體生物提供外部光照，因?yàn)锽LI是通過體內(nèi)的熒光素在熒光素酶的催化下產(chǎn)生的氧化反應(yīng)顯像。許多熒光素酶基因都可以通過轉(zhuǎn)染的方式進(jìn)入生物系統(tǒng)，并表達(dá)相應(yīng)的熒光素酶。BLI沒有自體熒光的干擾，因此相對于外源熒光分子影像，BLI具有更高的靈敏度和信噪比。體外進(jìn)行反義寡核苷酸治療或者將產(chǎn)品直接注入動物模型后，可以通過檢測生物發(fā)光產(chǎn)物或熒光蛋白(如綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白)來檢測基因沉默效果。這將有助于在進(jìn)行下一步人體試驗(yàn)前篩選最優(yōu)的反義寡核苷酸治療方法和最優(yōu)的劑型。McCaffrey等[18]證明了使用BLI檢測siRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和評估基因沉默效果的可行性。有學(xué)者通過BLI對反義寡核苷酸治療的基因沉默的動力學(xué)進(jìn)行了研究，用來篩選最好的基因沉默方法，同時基于體外熒光素酶的降低來模擬或預(yù)測siRNA有效劑量[19]。但由于BLI顯像需要基因轉(zhuǎn)染，這項(xiàng)技術(shù)在人體的應(yīng)用受到了限制。

2 PET及SPECT

PET和SPECT是核素顯像技術(shù)，在活體中通過使用放射性示蹤劑以及檢測γ射線從分子水平提供檢測對象的分子特征信息，兩種顯像系統(tǒng)均有良好的組織穿透性和全身顯像高敏感性的特點(diǎn)。通過被放射性探針標(biāo)記的siRNA，可以無創(chuàng)地對相應(yīng)反義寡核苷酸治療藥物的灌注、藥動學(xué)和生物學(xué)分布進(jìn)行評估。PET及SPECT具有實(shí)時活體顯像的優(yōu)勢，并且對于同一動物可以在不同時間點(diǎn)進(jìn)行研究，相對于傳統(tǒng)方法減少了實(shí)驗(yàn)動物的用量。

2.1PET 用于PET的放射性同位素由于原子核的不穩(wěn)定性經(jīng)過β plus(β+)衰變，基于正電子湮滅產(chǎn)生了兩個方向相反的γ射線，通過γ相機(jī)監(jiān)測，提供了感興趣區(qū)域角度和距離的信息，這使PET具有高敏感性和重建定量斷層圖像的優(yōu)勢。PET在反義寡核苷酸治療中被用于研究藥動學(xué)和藥物生物學(xué)分布。在反義寡核苷酸治療中，PET顯像劑有兩種標(biāo)記方法：一種是標(biāo)記siRNA本身，這種方法可能會影響siRNA的功能、特異性或反義寡核苷酸治療的效果；另一種是標(biāo)記siRNA載體，這種方法不會影響siRNA的有效性，但是圖像數(shù)據(jù)代表的是載體而不是siRNA的位置信息[20]。18F(t1/2=109.8 min)和64Cu(t1/2=12.7 h)等短半衰期同位素經(jīng)常在PET中被用作標(biāo)記siRNA分子或其載體系統(tǒng)的放射性示蹤劑。對于PET來說，為了對特定的器官和組織特異性顯像,需要研發(fā)特殊的放射性示蹤劑。在一項(xiàng)研究中[21]，鏤空殼體結(jié)構(gòu)的黃金納米微球被設(shè)計成為siRNA轉(zhuǎn)染載體系統(tǒng)，用于轉(zhuǎn)染B細(xì)胞核因子κ輕鏈增強(qiáng)子的siRNA。通過將1,4,7,10-輪環(huán)藤寧-1,4,7,10-乙底酸的衍生物結(jié)合在納米微球表面，并用64Cu標(biāo)記進(jìn)行顯像。在宮頸癌荷瘤裸鼠靜脈注射藥物后，PET/CT圖像顯示靶向的黃金納米微球在腫瘤中的集聚明顯高于非靶向的黃金納米微球。在18F標(biāo)記的siRNA研究中[22]，用氟原子或甲氧基基團(tuán)替換掉siRNA序列的特定核苷酸的2′羥基基團(tuán)，最終結(jié)果顯示反義寡核苷酸治療效果相似。在嚙齒類動物靜脈注射18F標(biāo)記的siRNA(氟或甲氧基修飾或者不修飾)后行PET檢查，圖像顯示放射性物質(zhì)迅速被腎臟和肝臟清除，盡管siRNA的組織分布相似，但氟修飾的siRNA與甲氧基修飾和不修飾的siRNA相比有更持久的血液濃度和穩(wěn)定性。Hatanaka等[23]運(yùn)用N-琥珀酰亞胺-4-18F-氟苯甲酸標(biāo)記siRNA進(jìn)行實(shí)時顯像研究siRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)，PET圖像顯示18F標(biāo)記的“裸”siRNA在血液中被迅速清除并從腎臟排泄，然而18F標(biāo)記的siRNA與陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物傾向于在肺內(nèi)集聚。現(xiàn)在對于反義寡核苷酸治療的PET來說，需要針對不同目的開發(fā)新的特異性顯像劑實(shí)現(xiàn)特異性顯像。更重要的是，迫切需要一種簡單高效的18F標(biāo)記siRNA方法，因?yàn)橐延械膫鹘y(tǒng)方法不僅耗時長且產(chǎn)量低[24]。

2.2SPECT 與PET相似，SPECT是利用放射性同位素發(fā)射出單個γ射線進(jìn)行顯像。相比而言，因?yàn)镾PECT不需要回旋加速器制作短半衰期放射性同位素，所以SPECT價格明顯低于PET[25]。SPECT使用長半衰期的同位素或通過發(fā)生器洗脫得到的同位素，如111In(t1/2=2.8 d)、99Tcm(t1/2=6 h)、123I(t1/2=13.3 h)和131I(t1/2=8 d)在活體器官中通過觀察放射性分布和代謝來提供局部的功能信息。Liu等[26]用一種99Tcm的螯合劑HYNIC(hydrazinonicotinamide)修飾siRNA，通過γ射線計數(shù)和微量自動射線照射技術(shù)，在細(xì)胞水平監(jiān)測siRNA，同時，通過荷瘤小鼠的全身顯像來研究siRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)過程和生物學(xué)分布。Merkel等[27]同樣也使用了SPECT監(jiān)測發(fā)射γ射線的放射性同位素(如111In/99Tcm)標(biāo)記的siRNA的生物學(xué)分布和藥動學(xué)情況。在實(shí)時灌注顯像的研究中，通過標(biāo)記的放射性同位素發(fā)射的γ射線可以看到siRNA迅速在肝臟和腎臟集聚，通過閃爍計數(shù)定量感興趣區(qū)的siRNA，結(jié)果顯示，siRNA在血池的半衰期短于3 min，迅速排入膀胱。SPECT使用的γ光子無法提供足夠的空間信息進(jìn)行斷層重建，因此SPECT需要設(shè)計特定儀器進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，并且SPECT的敏感性比PET低一個數(shù)量級[25]。

3 MRI

MRI是一個應(yīng)用非常廣泛的技術(shù)，MRI具有高空間分辨力，深部組織穿透性及良好的軟組織對比度的特點(diǎn)。在臨床上已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于解剖學(xué)和組織的功能的研究。可以同時用于顯像和siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)的MRI對比劑研發(fā)，是現(xiàn)在RNAi分子影像研究的熱點(diǎn)之一。對比劑根據(jù)磁共振特性和弛豫機(jī)制可以分為T1對比劑和T2對比劑。超順磁性氧化鐵納米微粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)可以在T2加權(quán)成像時降低特定組織的自旋弛豫時間，屬于T2對比劑的一種，目前臨床上有許多種SPIONs可以選擇。Mok等[28]基于SPIONs設(shè)計合成了一種對pH敏感的裝載有siRNA的納米微粒，這種納米微粒是常用于siRNA轉(zhuǎn)染的大分子對SPIONs修飾而成，并在表面涂有抗綠色熒光蛋白siRNA和腫瘤特異性配體(氯霉素)。與現(xiàn)在市場上常見的T2對比劑相比，該納米微粒對圖像對比度提升更明顯。更有趣的是在pH為7.4時，該納米粒子并不會引發(fā)明顯的細(xì)胞毒性，然而在pH為6.2時由于酸性環(huán)境的誘導(dǎo)，通過伯胺的質(zhì)子化作用會產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性。同時，由于在pH為7.4時該納米粒子表面的負(fù)電荷是在pH為6.2時的3倍，進(jìn)入細(xì)胞更加困難，因此在酸性環(huán)境下siRNA基因沉默效果明顯高于在正常生理環(huán)境中的效果。在另一項(xiàng)研究中[29]，在表面涂有聚乙二醇-PEI復(fù)合物的SPIONs上，進(jìn)一步通過針對雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂CD2的單鏈抗體片段進(jìn)行修飾，合成一種新的納米微粒。該納米微粒可以將Bcl-2 siRNA帶入腫瘤細(xì)胞,不僅可以沉默Bcl-2 mRNA表達(dá)，同時還可以用MRI對siRNA轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行確定。除了T2增強(qiáng)對比劑，順磁性物質(zhì)，如釓劑、錳劑等可以通過減少T1弛豫時間來提升T1信號強(qiáng)度，被廣泛應(yīng)用為T1增強(qiáng)對比劑。在Bae等[30]的研究中，使用鏤空氧化錳納米微粒作為一體化的納米載體，同時對腫瘤進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染和MRI。鏤空氧化錳納米微粒與結(jié)合有分支狀PEI的3，4-二羥基左旋苯丙氨酸依靠3,4-二羥基左旋苯丙氨酸和金屬氧化物之間的強(qiáng)親和力連接，這個復(fù)合物進(jìn)一步通過赫塞汀(靶點(diǎn)為表達(dá)表皮生長因子受體2的癌癥細(xì)胞的單克隆抗體)修飾。近年來，T1～T2雙模態(tài)增強(qiáng)對比劑的發(fā)展受到越來越多的關(guān)注，因?yàn)樗梢酝瑫r為高組織分辨率的T1加權(quán)和高病變檢出率的T2加權(quán)提供對比。Wang等[31]報道了低分子量PEI包裹和釓劑嵌入的氧化鐵納米團(tuán)簇用于siRNA轉(zhuǎn)染T1～T2雙模態(tài)MRI，在雙模MRI引導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染過程中，釓劑嵌入的氧化鐵-低分子量PEI包裹表現(xiàn)出了在MRI測量中的良好的弛豫改變特性和綠色熒光蛋白表達(dá)中的抑制性。

4 超 聲

超聲在臨床上非常普及，具有高空間、時間分辨率的特點(diǎn)，且價格低廉。超聲對比劑對于提高超聲圖像病變對比度非常重要，一些對比劑已經(jīng)用于臨床與科研，如微泡、納米微滴、納米微泡和脂質(zhì)體[32-34]，這些對比劑表面通常有蛋白、多肽、脂質(zhì)或表面活性劑來保持其在血液中的穩(wěn)定性，同時用來擺脫單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的清除。對比劑中荷有空氣或生物學(xué)的惰性氣體來增強(qiáng)回聲，另外，一些腔隙中存有氣體的固體納米微粒或由可以產(chǎn)生氣體材料組成的納米微粒也已經(jīng)用來增強(qiáng)超聲圖像的對比度[35]。

超聲在反義寡核苷酸治療中具有潛在的優(yōu)勢。siRNA分子可以通過連接于微氣泡的表面、包裹在脂質(zhì)雙分子層中等方式與超聲對比劑結(jié)合，制作超聲探針。在低聲壓條件下(<100 kPa)，當(dāng)超聲探針到達(dá)腫瘤的血管時，超聲可以用于反義寡核苷酸治療的疾病診斷和監(jiān)測治療效果；在高聲壓條件下(>100 kPa)超聲可以用于破壞超聲探針，在指定位置釋放探針裝載的“貨物”(藥品或RNAi)，同時還可以改變特定區(qū)域細(xì)胞膜的通透性，使更多的siRNA進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)更好的基因沉默效果，因此超聲可以提高反義寡核苷酸治療的效果[33,36]。如Carson等[37]將定向表皮生長因子受體的siRNA連接于微氣泡表面，每109微氣泡可以運(yùn)載7 g的siRNA,并且可以保護(hù)其中的siRNA不被RNA水解酶消化。實(shí)驗(yàn)證明裝載有表皮生長因子受體-siRNA的微氣泡在體外可以降低鼠類鱗癌細(xì)胞表皮生長因子受體的表達(dá)；在活體試驗(yàn)中，超聲在特定腫瘤區(qū)域誘發(fā)的微氣泡破裂釋放siRNA可以有效地延緩腫瘤的生長，同時可以通過超聲監(jiān)測腫瘤體積。相比于微氣泡，小體積的超聲探針，如納米氣泡、納米粒子，納米脂質(zhì)體等有更好的組織穿透性，可以更好地在病變組織中聚集，在病灶的診斷和超聲引導(dǎo)的反義寡核苷酸治療方面有更好的效果[34,38]。另外，超聲探針可以同時裝載多種物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)不同功能，如抗癌藥物和DNA質(zhì)粒可以同時裝載于超聲探針，在進(jìn)行腫瘤成像同時實(shí)現(xiàn)腫瘤聯(lián)合治療[32]。

5 小 結(jié)

分子影像技術(shù)進(jìn)展為反義寡核苷酸治療的成像和量化提供了新方法，并且有助于研究者進(jìn)一步理解RNAi生物學(xué)進(jìn)程和沉默機(jī)制。在分子影像的幫助下，將臨床前期研究中的成果向臨床轉(zhuǎn)化非常重要。目前，許多成像方式(如光學(xué)、PET/SPECT、MRI和超聲成像)已經(jīng)用于評估siRNA的轉(zhuǎn)染、確定其生物學(xué)分布及監(jiān)測治療效果。對于反義寡核苷酸治療的進(jìn)展，特別是臨床前期研究的進(jìn)展發(fā)揮了重要作用。盡管每一個成像方式都有其獨(dú)特的優(yōu)勢，但同樣每一種成像方式也有其固有的缺陷，因此無法通過單一的成像方式獲得靶器官結(jié)構(gòu)和功能等各個方面的準(zhǔn)確、可靠的信息。為了更好地追蹤標(biāo)記的siRNA、轉(zhuǎn)運(yùn)載體，更準(zhǔn)確地評估治療效果，多模態(tài)成像成為未來發(fā)展的趨勢[39]。然而，在發(fā)展多模探針的發(fā)展過程中，特別是多模探針在活體中的應(yīng)用還存在著一些挑戰(zhàn)：可能面臨單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬造成的目標(biāo)區(qū)域探針無法聚集；探針清除緩慢，長時間滯留在組織和器官中，具有長期的細(xì)胞毒性。另外，不同的顯像模式在敏感度方面差異巨大，因此將兩種探針結(jié)合在一起需要前期全面仔細(xì)的設(shè)計。合理設(shè)計的分子成像探針對于精準(zhǔn)地監(jiān)控反義寡核苷酸治療的生物學(xué)進(jìn)程、全面地認(rèn)識其在疾病治療中的潛能、幫助反義寡核苷酸治療進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。