微RNA與椎間盤退變：從機制向臨床轉化邁進

邵 拓，胡宇航，張軒碩，沈洪濤，于占革

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院脊柱外科,哈爾濱 150001)

下腰痛作為現代社會最常見的疾患之一，已嚴重影響人們的工作和生活。病因學研究顯示，椎間盤退變及其繼發的病變是產生疼痛的主要原因[1]。對椎間盤退變疾病的治療方法目前僅局限于保守治療及外科手術干預等對癥治療，尚無有效的早期干預和延緩退變進程的方法。因此，為了尋找良好的治療方式，探究其疾病發生的分子機制成為研究熱點。微RNA(microRNA，miRNA)是一類短序列的RNA，主要通過作用于目標RNA，降解或阻遏信使RNA的翻譯，使靶基因在細胞中差異性表達，進而調控下游通路的激活。隨著對miRNA研究的深入，椎間盤退變的分子機制得到了更詳盡的闡述。已有眾多研究報道miRNA在神經退行性疾病、骨關節退行性疾病中均發揮重要作用[2-3]，甚至可以成為調控腫瘤疾病進程的靶點[4]，這種miRNA的腫瘤治療技術也已進入臨床審核階段。提示應用miRNA的可行性，研究者希望將此種療法應用于椎間盤退變的領域，并進行了大量研究，現對miRNA在椎間盤退變中的作用進行綜述，同時指明進一步向臨床成果轉化的方向。

1 miRNA調控髓核退變的分子機制

基因芯片對比研究發現，一些miRNA在退變的髓核細胞中的表達與正常髓核細胞中存在顯著差異，這些差異表達的miRNA通過調控其各自的上下游通路可能參與髓核細胞退變的進程，調控通路多有交叉并行，構建出一個龐大的miRNA調控網。而這些miRNA的作用多遵循已發現的幾種髓核退變機制學說(表1)。

PI3K/AKT：磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B；casepase-3：胱天蛋白酶-3；MAPK：促分裂原活化的蛋白激酶；HOXA：同源異型盒A家族；ATG：自噬相關基因；PDCD：細胞程序性死亡因子；AP：核轉錄激活蛋白；PTEN:人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因；IL：白細胞介素；pERK：蛋白激酶R樣內質網激酶；cyclin：細胞周期蛋白；SOX：SRY相關同源盒；GDF：生長分化因子；MMP：基質金屬蛋白酶；Chsy：硫酸軟骨素糖基轉移酶；TRAF：腫瘤壞死因子受體相關因子；↑：上調；↓：下調；-：未知

1.1 調控髓核細胞凋亡、增殖 凋亡增殖學說認為，髓核的凋亡導致椎間盤組織中髓核細胞的數量的減少，因此難以維持間盤結構和功能，進而導致間盤退變[5]。但在退變早期，為了補充丟失的細胞，髓核細胞發生異常增殖進行自我修復[6]。當增殖難以補充凋亡，發生失代償時，椎間盤退變程度將不斷加劇。因此，抑制髓核細胞的凋亡，并促進髓核細胞增殖可能延緩椎間盤的退變進程。

在對髓核退變相關miRNA的研究發現，大多miRNA在退變的髓核中呈高表達，且對凋亡起促進作用。如miR-210、miR-328-5p、miR-589-3p可以通過Fas通路、受體型酪氨酸蛋白激酶通路等促進髓核細胞凋亡[7-9]。在另一方面，miR-125a、miR-129-5p等抑制髓核凋亡和自噬過程[10-11]，研究者還發現某些 miRNA，如miR-96可以促進髓核細胞的增殖[12]。證明在髓核退變過程中，同時存在髓核細胞的凋亡和增殖，且隨著退變程度增加，凋亡和增殖也愈加活躍，相關miRNA的表達量也隨之增加或降低。而通過外源性調控以上這些miRNA的表達，可以間接增加髓核細胞增殖、減少凋亡，延緩椎間盤退變的進程。不過，也有研究顯示，損傷模型的髓核細胞中miR-27a的表達上調，而進一步通過表達載體上調miR-27a時，卻引起磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路介導的凋亡減少[13]。這與以往的“凋亡等于退變”或“凋亡程度等于退變程度”的觀點不同，提示，在髓核退變進程中，髓核細胞凋亡和自我保護性增殖的觸發或許都存在一個最低臨界點和最高峰值。但這種理論還需更多研究證實，而目前的退變凋亡學說仍存在缺陷，需要進一步的完善和補充。

1.2 通過基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)家族調控細胞外基質穩態失衡 細胞外基質的穩態失衡也是椎間盤退變的機制。細胞外基質中主要含有MMP、崩解素、含凝血酶基序的金屬蛋白酶等分解因子，以及Ⅱ型膠原、糖苷類物質等合成因子。正常情況下，分解與合成同時存在，互相形成穩態，當有外界因素影響時，分解因子增加而合成因子減少，造成了穩態失衡，髓核靜水壓力下降，使脊柱的壓縮載荷無法平均分布，最終導致椎間盤退變[14]。

對比退變髓核與正常髓核進行基因芯片發現，差異表達的miRNA多數通過調控MMP蛋白家族發揮作用。如miR-132、miR-133a、miR-127-5p、miR-155、miR-210、miR-663b等，可通過其不同靶基因，最終作用于MMP-16、MMP-9、MMP-13、MMP-3、MMP-2來調控細胞外基質的穩態平衡，使之趨向于分解[15-20]。除miR-155和miR-663b為負向調控外，其余均為正向調控[20-21]。通過干擾RNA抑制這些miRNA的表達可減少MMP的合成，減少細胞外基質的分解，達到減緩間盤退變的效果。

針對miRNA的研究為將MMP作為調控髓核退變的目標靶點提供了可行性證據，由于MMP具備酶的高效性，調控MMP的合成可最大化miRNA對細胞外基質的調控效應，為調控眾多MMP的功能提供了統一化解決模式，同時也鞏固了細胞外基質穩態學說的地位。

1.3 調控炎癥因子的分泌 研究者認為，開始發生退變的髓核細胞會與免疫系統細胞一同分泌炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1α/β、白細胞介素-6和白細胞介素-17等，這些炎癥因子具有促進髓核退變的作用[22]。miR-21和miR-27的上調都會增加炎癥因子的分泌[23-24]，而上調miR-146a卻可以通過腫瘤壞死因子受體相關因子/核因子κB通路來減少退變髓核細胞中炎癥因子的分泌[25]。說明通過調控miRNA來減少髓核細胞分泌炎癥因子可行，但以上miRNA能否對免疫細胞的分泌產生調控作用尚待研究。

2 miRNA多向調控退變機制

人們曾假設椎間盤退變的上述3種機制(細胞增殖凋亡、細胞外基質穩態及炎癥反應)是互相聯系，互相促進的。凋亡的髓核細胞引起炎癥反應使免疫細胞趨化，進而使細胞外基質分解因子增加，分解產物進一步促進退化的椎間盤釋放趨化因子。趨化因子促進T細胞、B細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞激活并浸潤退變的椎間盤組織，進一步放大炎癥級聯反應，促進髓核細胞的凋亡，導致椎間盤退變加速[26]。這形成了一個惡性循環，使髓核愈加退變，僅切斷其中一環難以完全阻遏此循環，但miRNA及其靶點具有多向調控功能，使同時調控多機制成為可能。

同一個miRNA可同時調控髓核細胞異常凋亡增殖和細胞外基質穩態兩種機制(如miR-210,miR-589-3p等)，miRNA的過表達會同時促進髓核細胞凋亡和MMP分解Ⅱ型膠原，加快髓核退變[8,20]。除此之外，過表達miR-27或miR-21會在促進炎癥因子釋放的同時促進髓核細胞的異常增殖或凋亡[13,23-24]。當miRNA受干擾后，相應的凋亡增殖、基質穩態、炎癥因子釋放均得到抑制。miRNA的調控不僅具有多向性，還具有歸一性，雖然miRNA作用于不同的靶基因(P-p38、pERK1/2、GDF5)，但通過激活促分裂原活化的蛋白激酶通路，最終表現為炎癥因子的釋放量和MMP的生成量的同向增加或減少[15,24]。

miRNA加強了上述3種機制間的聯系，并在此基礎上，構建了一個復雜的分子調控關系網，現今所探知的miRNA及其通路之間的互相作用關系只是其中一小部分，研究此關系網中的“樞紐”調控點將對未來選擇miRNA上下游調控的起點和靶點具有指導作用。同時，還有一部分miRNA的調控功能獨立于以上幾種主流機制之外，如抑制miR-194、miR-515會阻遏其靶基因硫酸軟骨素糖基轉移酶1/2/3 mRNA的翻譯，中斷下游硫酸軟骨素糖基轉移酶的合成，阻礙硫酸軟骨素的生成，使椎間盤細胞的生物骨架的穩定性減弱，降低了椎間盤的負重強度、黏彈性等，從而促進椎間盤退變[27]。還有研究表明，髓核退變與血管長入相關，正常的髓核細胞能夠抑制血管內皮細胞增殖，而退變的髓核抑制效果降低[28]，使miR-21調控的血管內皮的增殖和遷移增加[29]，促使微血管長入髓核，破壞了椎間盤內微環境。以上關于miRNA的研究，增加了研究者對椎間盤退變機制的認知，對于發現新的分子機制具有重要引導意義。

3 miRNA在髓核退變中的應用

3.1 退變模型的構建

3.1.1 細胞水平退變模型構建 現階段研究者對于有關髓核退變的miRNA研究多停留于細胞水平，但研究人員采用的退變髓核樣本不盡相同，導致實驗結果不存在可比性。同是對于miR-21在髓核退變中作用的實驗研究，腰椎間盤突出患者術中摘除的自然退變髓核細胞中miR-21的表達量較正常對照組顯著增高[30]，而在腫瘤壞死因子-α誘導退變的髓核細胞模型中，miR-21的表達量卻顯著低于正常對照組[31]，產生了完全相悖的結論。原因可能是體外建模的退變髓核細胞多處于退變前期，與已經達到手術指征的患者樣本相比退變程度差異顯著。對于細胞水平的髓核退變程度，學者們多通過免疫熒光測定細胞內Ⅱ型膠原含量予以衡量[20-22]，但目前尚缺乏統一性標準。體外促髓核細胞退變模型尚不能完全模擬體內的自然退變水平，仍需進一步改進。

3.1.2 動物水平髓核退變模型構建 盡管眾多學者對miRNA調控椎間盤退變的分子機制及其調控靶點已解釋得較為清楚，但這些研究卻大多局限于細胞水平，miRNA在椎間盤退變中的體內應用效果鮮有報道。報道過的動物的椎間盤退變模型構建方法主要包括：①利用特殊動物沙鼠的自發性椎間盤退變模型[32]；②改變椎間盤力學環境的退變模型；③穿刺或穿刺抽吸髓核構建的退變模型；④化學損傷造成的椎間盤退變動物模型；⑤基因敲除技術構建的椎間盤退變模型[33]。這幾種方式各有其利弊，但綜合倫理學及可重復性和經濟因素，應用最廣的為椎間盤穿刺或穿刺髓核抽吸法。椎間盤穿刺法需要構建的時間較長(約4周)，椎間盤穿刺髓核抽吸法所需時間較短(約2周)，經磁共振成像及病理學切片驗證均可產生良好的誘發間盤退變效果[34]。所用動物多為大鼠或新西蘭大白兔，動物的性別可能是影響結果的變量之一，在研究中均給予控制。但在針對人的miRNA的研究中發現，性別并非是影響miRNA表達量的因素[35]。雄性大鼠的椎間盤穿刺模型是現在應用較廣泛的椎間盤退變建模方案。

3.2 臨床應用可行性及安全性 在椎間盤內注射富集miRNA的間充質干細胞外泌體是已在小鼠體內證實的可行miRNA體內給藥方式，可充分發揮miRNA的延緩髓核退變功能[31]。除直接間盤注射外，將富集miRNA的外泌體經皮穿刺椎弓根給藥或許是另一種體內給藥方式，因為有研究表明骨髓間充質細胞外泌體可以通過終板軟骨屏障[36]。諸如靜脈注射的其他給藥方式，雖在腫瘤治療方面取得一定成果，但在椎間盤退變領域尚無成功案例。

miRNA的多調控性在抑制髓核細胞凋亡的同時也可能會引起腫瘤細胞的增殖和遷移[37]，以及加速阿爾茨海默病的發展[38]。這可能會限制miRNA在同時患有惡性疾病及阿爾茨海默病的椎間盤退變疾病患者中的應用。為了了解miRNA在椎間盤退變患者中應用的安全性，有必要進一步驗證其劑量對其他疾病發生發展的影響。同時，有研究表明，在椎間盤退變的患者中，外周血的miRNA表達量與正常人群存在顯著差異[39]。因此，在miRNA局部椎間盤內給藥后測定靜脈血中的miRNA水平可能也是驗證miRNA在體內應用的安全性的方法之一。

4 結 語

miRNA因具有多調控性、構建簡單的特點，被認為是未來延緩和治療髓核退變的重要靶點。在髓核細胞異常增殖和凋亡、調控細胞基質外穩態平衡以及調控髓核細胞炎癥反應因子的分泌中均發揮重要的作用，但由于數量龐大，作用復雜，探究幾種機制的共調控miRNA是未來研究的重點。

在今后進行miRNA與髓核退變的研究時，應采用患者術中摘取的髓核進行實驗，以避免細胞建模造成的退變程度不一致影響實驗結果。同時，由于miRNA具有促腫瘤細胞生長遷移作用，在治療椎間盤退變的體內研究中，探究給藥方式、劑量和安全性是進一步臨床應用的前提。如果有條件，對外周血中的miRNA表達量也應加以定量。富集miRNA間充質干細胞外泌體椎間盤注射在椎間盤退變的臨床治療上已初見成效，或成為未來miRNA體內給藥的主要途徑。綜上所述，miRNA對椎間盤退變疾病治療的應用前景不可估量。