糖尿病對心肌低氧誘導因子-1的影響及研究進展

侯天亮，楊 龍，鄭 宏

(新疆醫科大學第一附屬醫院麻醉科，烏魯木齊 830054)

眾所周知，處理心肌梗死最有效的方法是縮短心肌缺血時間，盡早恢復血液灌注，但血液供應的快速恢復也會對組織造成更大的傷害，這一矛盾現象稱為心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷[1]。心血管手術患者在圍術期難免會發生不同程度的I/R損傷,尤其合并糖尿病時，患者術后心臟的相關并發癥和死亡率都將明顯增加[2]。國際糖尿病聯盟發布的第8版糖尿病地圖顯示,目前全球糖尿病患病人數已達4.51億，預計到2045年，這個數字將增加到6.93億，并呈逐年增長的趨勢[3]。因此，如何防治糖尿病患者圍術期I/R損傷將是未來亟待解決的難題。

研究顯示，低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor，HIF-1)在機體抵抗I/R損傷中發揮重要作用，其下游的靶基因在心肌組織缺血缺氧的情況下被大量激活，通過調控心肌細胞線粒體自噬、血管形成、活性氧平衡等途徑發揮心肌保護作用[4]。然而，患有糖尿病時，HIF-1介導的心肌保護作用卻大大減低[5]。現就糖尿病對心肌HIF-1的影響及研究進展予以綜述。

1 HIF-1概述

1.1 HIF-1的結構與代謝 HIF-1是低氧誘導因子家族(hypoxia inducible factors,HIFs)成員之一，由組成性表達的HIF-1β亞基和受氧濃度調節的HIF-1α亞基組成。在常氧條件下，HIF-1經脯氨酸羥化酶(prolyl-4-hydroxylase domain-containing enzymes,PHD)羥化、E3泛素連接酶連接，最終被蛋白酶體識別和降解[6]。有研究表明，HIF通路與泛素系統的相互作用不是一條單向通路，HIF通路的成分與泛素系統存在相互調節[6]。在缺氧條件下，PHD的活性受到抑制，HIF-1的泛素化和降解減少，細胞核中HIF-1α 與HIF-1β形成異源二聚體，在CREB-結合蛋白/p300等轉錄激活因子的存在下，結合到靶基因啟動子的低氧反應元件上，調控下游一系列靶基因的轉錄，從而有利于細胞在低氧條件下生存[7]。

1.2 HIF-1是介導心肌對抗I/R損傷的核心靶點 心肌缺血預處理(ischemia preconditionin,IPC)是指心肌在長時間缺血之前經歷幾次短暫的I/R損傷的過程。IPC可有效減輕I/R損傷，這是迄今為止發現的最有效的心肌保護策略[8]。IPC的這種心肌保護作用很大程度上是通過激活HIF-1下游靶基因發揮作用的[9]，當HIF遺傳缺失時，IPC的心肌保護作用也會減弱[10]。但出于倫理學考慮，IPC的臨床應用受到很大程度的限制。近年來動物研究表明，七氟醚后處理可通過上調心肌細胞HIF-1的水平，產生類似IPC的心肌保護作用，并可避免IPC的倫理學問題，是一種非常有潛力的心肌保護策略[11]。

2 糖尿病對心肌HIF-1的影響

2.1 HIF-1信號轉導 糖尿病是一種影響葡糖糖穩態的疾病，影響機體不同的器官和系統，導致嚴重并發癥，如心血管疾病、糖尿病腎病、神經病變、視網膜病變以及影響傷口愈合等。組織暴露于高血糖環境被認為是影響并發癥發生的主要因素，但即使嚴格控制血糖也不能完全預防并發癥的發生[12]。在高糖環境下，通過多元醇途徑代謝的葡糖糖增加，最終使煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態/氧化態的比值增大，機體出現“假性缺氧”現象。在一項基礎研究中，試驗者使用哌莫硝唑(缺氧組織標志物)檢測機體的缺氧水平發現，糖尿病組織中哌莫硝唑的水平明顯高于非糖尿病組織[13]。在蛋白質水平上，除缺氧刺激可穩定HIF-1α的表達，有氧糖酵解的產物(主要是丙酮酸鹽)也可以穩定其表達。相反，高糖通過修飾協同激活因子p300影響HIF-1的轉錄，從而在不影響HIF-1α蛋白穩定性的情況下，降低HIF-1的轉錄活性[12]；高糖還通過碳水化合物反應元件結合蛋白激活HIF-1介導的信號轉導[14]；此外，高糖誘導的信號轉導失調還包括HIF-1對低氧狀態的反應，在高血糖環境下培養的細胞面對缺氧刺激，HIF-1不但沒有被及時激活反而降解增加[15]。因此，糖尿病不僅會導致缺氧，還會影響HIF-1信號轉導。如果細胞/組織不能對缺氧做出及時的應激反應，那么糖尿病患者并發癥的發生率會大大增加。

2.2 血管生成因子 當組織灌注不足時，低氧會激活HIF-1，進而產生大量調控血管生成的因子，包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質細胞衍生因子-1、血管生成素等，導致骨髓源性血管生成細胞動員，增加血管生成和動脈重塑[16]，這對于心肌缺血/缺氧誘導的血管生成的調節和損傷心肌組織的恢復至關重要。在糖尿病環境中，由于細胞對缺氧反應遲鈍,大部分HIF-1α靶基因降低,糖尿病患者心室中VEGF和VEGF受體2含量降低[17]。同樣，在糖尿病大鼠中，VEGF-A及其受體VEGF受體1和VEGF受體2在基因和蛋白水平的表達也降低，當心肌發生缺血/缺氧損傷時，HIF-1/VEGF通路介導的血管生成及修復受損血管的作用減弱，新生的毛細血管數量減少，有效側支循環血管形成障礙[18]，心肌受損；糖尿病患者肢體末端傷口愈合障礙和血液循環不良也是由于HIF-1/VEGF途徑受損，肢體末端血管密度下降所致[19]；VEGF的表達水平在腎小球中明顯下調，并導致足細胞死亡，是血栓性微血管病變和糖尿病腎病的重要環節[20]。此外，HIF-1下游的其他靶分子也能促進血管生成，如內皮型一氧化氮合酶、基質細胞衍生因子-1等，這些分子在糖尿病心肌中同樣低表達，與VEGF的調控紊亂共同導致糖尿病心肌I/R時側支循環血管生成障礙。

2.3 心肌能量代謝 HIF-1對低氧誘導的糖酵解關鍵酶有調控作用，通過激活丙酮酸脫氫酶激酶1使心肌能量代謝從氧化磷酸化轉變為糖酵解，還可增加丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶等糖酵解關鍵酶的水平。心肌缺血/缺氧時，通過糖酵解途徑產生維持細胞存活的基本能量有利于為能量需求量很大的心肌組織供能。糖尿病患者由于胰島素缺乏或敏感性降低，導致機體利用葡糖糖的能力受限，使機體長時間處于高血糖狀態下，導致機體甲基乙二醛的產生和積累增加[21]。研究證實，甲基乙二醛通過誘導缺氧條件下HIF-1的降解而損害細胞適應低氧張力的能力[15]。由于HIF-1的降解，丙酮酸脫氫酶激酶1等一系列HIF-1下游能量代謝的關鍵靶基因表達降低，心肌不能從無氧酵解途徑獲取足夠的能量，進而加快了心肌細胞凋亡；同時在糖尿病環境下由于HIF-1下調，損害了葡糖糖轉運體4向骨骼肌質膜的轉運，影響糖吸收[22]，這就使本來糖利用障礙的心肌細胞更加缺乏維持生命的能量，從而加重心肌損傷。

2.4 活性氧類(reactive oxygen species,ROS)和炎癥 ROS與HIF-1的相互作用是復雜的、雙向的，生理水平的ROS具有信號轉導功能，調節機體的多種生理過程,可穩定并激活HIF-1[23]。正常情況下，HIF-1主要通過以下幾種途徑減少ROS的產生，從而起到心肌保護的作用。①改變能量代謝方式，減少電子傳遞鏈產生ROS的量[24]。②HIF-1誘導線粒體選擇性自噬，清除受損老化的線粒體，從而減少ROS的生成[24]。③HIF-1α通過誘導miR-210轉錄，阻斷線粒體呼吸和電子傳遞鏈的活性，減少ROS的產生[24]。在糖尿病心肌中，高血糖有助于葡萄糖的自動氧化、代謝和糖基化終末產物的產生，過量ROS的產生是糖尿病的標志物。超氧化物歧化酶是一種主要的內源性抗氧化酶，高糖條件下在機體的表達顯著降低[25]。當糖尿病心肌發生I/R時，過量的ROS在鐵離子的作用下激活PHD，并可提高泛素蛋白酶體的活性，進而促使HIF-1α在轉錄后降解；NO具有介導HIF-1α積累和活化的能力，但在糖尿病環境下，由于超氧陰離子(O2-)的過度產生，并與NO反應，使穩定狀態的NO的水平降低,從而失去活化HIF-1α的能力[26]。最新研究表明，過量的ROS是炎癥的主要驅動因素，而炎性因子也會反過來刺激ROS的大量產生，兩者相互協同，進一步加重心肌細胞損傷[27]。

2.5 線粒體自噬及凋亡相關蛋白 線粒體是真核生物細胞能量代謝的主要場所，同時也是細胞缺血/缺氧性損傷的主要目標。心肌細胞線粒體凋亡速度的加快是糖尿病心肌損傷的主要途徑。Bcl-2家族具有調控心肌線粒體凋亡途徑的作用，包括抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax以及p53上調的凋亡調節物(p53-upregulated modulator of apoptosis,PUMA)[28]，受HIF-1α直接轉錄調控的Bcl-xL蛋白、骨髓細胞白血病-1蛋白等分子是抗凋亡蛋白Bcl-2家族的重要成員[29]。當糖尿病心肌發生I/R損傷時，抗凋亡蛋白Bcl-xL、骨髓細胞白血病-1等的表達降低，線粒體的膜電位降低，并促進了細胞色素C釋放，激活了胱天蛋白酶-3,還可使PUMA的表達增加，最終加快心肌細胞的凋亡[30]。Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B interacting protein 3，BNIP3)是Bc1-2家族中BH3-only亞家族的成員之一，是一種線粒體外膜蛋白，受HIF-1的調控，在低氧時能被HIF-1轉錄激活，使BNIP3的表達上調。BNIP3的磷酸化程度直接決定其是促進凋亡還是促進線粒體自噬，在HIF-1介導的缺氧反應通路中發揮著重要作用。BNIP3絲氨酸17和24位點的磷酸化可直接促進與抗凋亡蛋白Bcl-xL的結合，直接招募自噬相關蛋白LC3Ⅱ促進線粒體自噬流的啟動[31]。然而BNIP3是否是HIF-1介導線粒體動態變化及糖尿病心肌代謝紊亂的關鍵低氧敏感基因尚不清楚。

3 HIF-1為靶點的糖尿病心肌保護策略

3.1 PHD抑制劑 常氧條件下，HIF-1的降解大致需要經過PHD羥化、E3泛素連接酶連接以及溶酶體識別3個步驟，在任一環節上阻止HIF-1的降解都能起到心肌保護的作用。目前，氯化鈷和去鐵胺是最常見的PHD抑制劑，可通過抑制PHD的羥化穩定HIF-1α。研究發現，去鐵胺和氯化鈷可以直接活化HIF-1，恢復七氟醚處理后對糖尿病大鼠心臟的保護作用[11,32]；此外，氯化鈷減少糖尿病腎病的組織學損傷以及蛋白尿也是通過上調HIF-1α基因實現的[33]；在1型糖尿病大鼠中，間歇性低氧可以降低糖尿病大鼠心臟中PHD2和PHD3的蛋白水平，誘導心臟組織中HIF-1α和VEGF蛋白的表達，減少氧化應激，對1型糖尿病大鼠的左心室具有良好的心血管重塑作用[34]。

3.2 抗氧化劑 糖尿病心肌ROS產生增多，機體氧化應激增強，HIF-1α水平降低。理論上講，應用抗氧化劑既可以降低機體氧化應激損傷，又能穩定HIF-1α的水平，但事實并非如此。使用維生素E和谷胱甘肽等抗氧化劑作為減輕氧化應激的治療策略并未證明是有效的，這可能是由于維生素E等抗氧化劑不加區別靶向造成的。SBT-20是一種具有靶向線粒體保護作用的新型肽類化合物。研究表明，SBT-20能靶向定位于線粒體內膜，有效降低線粒體中的ROS，從而達到保護線粒體，進而保護細胞的目的[35]。在多種I/R疾病如心肌梗死、器官移植以及腦卒中等動物模型中，SBT-20均顯示出較好的器官保護作用，因此靶向線粒體的抗氧化劑值得臨床驗證和推廣。此外，金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一種富含半胱氨酸短肽的金屬結合蛋白，其廣泛存在于生物體內，對多種重金屬具有高度親和力，不但可以防止重金屬對體內細胞的氧化損傷，而且MT對HIF-1還有活化作用，參與機體其他的生理和病理過程，如細胞增殖和存活等，有助于糖尿病心肌的葡萄糖利用和血管生成[36]。

3.3 生物工程技術 將無致病原性的腺相關病毒載體和目的基因HIF-1重組，并靶向轉導入糖尿病心肌，能夠起到上調機體HIF-1α水平，誘導下游關鍵靶基因表達，從而達到保護心肌的目的。Mace等[37]在2型糖尿病小鼠模型中導入HIF-1α重組腺病毒表達質粒，恢復了糖尿病心肌HIF-1α的表達水平，達到了加速組織修復的目的。局部腺病毒介導的穩定HIF-1α重組體可增加 HIF-1的活性，并使其下游調控血管內皮增殖的靶基因VEGF-A表達正常化，達到預防糖尿病并發癥的目的[38]。研究證明，通過轉基因手段使小鼠心臟特異性HIF-1α過表達，對糖尿病誘導的葡萄糖代謝和血管生成缺陷的心臟具有保護作用[39]。生物工程技術對于基因表達降低或信號通路受損的疾病具有獨到優勢，值得廣大研究者深入研究。

4 小 結

功能完整的HIF-1通過與低氧反應元件結合，調控下游血管內皮生長因子、線粒體凋亡相關蛋白、糖酵解關鍵酶等大量靶基因發揮心肌保護作用，同時也是IPC和七氟醚后處理等諸多心肌保護策略的核心靶點。然而，在糖尿病環境下，由于HIF-1信號轉導通路受損，VEGF、Bcl-2等下游靶基因表達水平降低、ROS產生過多，導致糖尿病心肌在I/R損傷時易損性增加。但目前對糖尿病心肌HIF-1表達弱化的具體機制仍然無法完全闡明，可能與機體長期高血糖狀態以及機體無菌性炎癥狀態有關。因此，深入探討糖尿病狀態下HIF-1信號通路受損的原因以及如何通過有效手段恢復糖尿病狀態下HIF-1介導的心肌保護作用將是后期研究的主要方向。