菟絲子總黃酮對卵巢早衰大鼠卵巢功能的作用研究

王永霞，馬 娜，鐘興明，崔 蓉，苗竹林

(1.國家衛生健康委員會男性生殖與遺傳重點實驗室，廣州 510600； 2.廣東省計劃生育科學技術研究所 生殖免疫遺傳中心,廣州510600；3.廣東藥科大學基礎學院,廣州 510610)

卵巢早衰是指女性40歲之前出現卵巢功能減退的現象，伴有高促性腺激素和低雌激素水平。卵巢早衰的病因非常復雜，目前研究已經明確的發病因素包括遺傳性、自身免疫性、感染性、醫源性、環境及心理等。80%以上的患者發病原因不明確,大多數患者得不到相應的病因診斷[1-4]。中藥菟絲子是中醫溫補腎陽的要藥，常用于治療婦科內分泌疾病,療效確切[5-7]。菟絲子是一種旋花科植物菟絲子或大菟絲子的成熟種子，主要生物活性成分為菟絲子總黃酮(total flavonoids from semen cuscutae,TFSC)。多項藥理研究發現，菟絲子及TFSC在改善人體的生殖內分泌功能、抗氧化、增強免疫力、保護心血管和抗突變等方面都有較好的作用，在改善和提高人體生殖內分泌系統功能方面的作用更加顯著[8-11]。王曉紅[12]研究發現，以菟絲子為主的抗衰復巢湯聯合激素補充療法能有效治療卵巢早衰，提高患者的生殖激素水平。但單獨應用TFSC對卵巢早衰的作用研究較少。本實驗通過建立成熟的大鼠卵巢早衰模型，觀察TFSC對卵巢早衰大鼠卵巢功能的作用，為TFSC在臨床的進一步應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑TFSC的提取與分離技術 取菟絲子藥材粉碎過篩后經石油醚脫脂，加75%乙醇6倍量，加熱回流提取2次，每次2 h。濾過，合并濾液，減壓回收75%乙醇，加水稀釋至0.1 g生藥/mL，置已經處理好的D101大孔樹脂柱中，以水洗至流出液近無色，棄去，再以梯度乙醇、水從低濃度至高濃度梯度洗脫，收集35%～65%濃度的洗脫液，減壓回收乙醇合并濃縮成稠膏狀，減壓干燥，粉碎，過篩即得總黃酮。

1.2 實驗動物與造模 200～250 g雌性健康SD大鼠由廣東省醫學實驗動物中心提供，適應性喂養2～3 d，連續5～10 d做陰道涂片，有動情周期的大鼠納入實驗。90只大鼠依據隨機數字法分為正常組、模型組、雌激素對照組以及TFSC低、中、高劑量(35、70、140 mg/kg)組，每組15只，除正常組不造模外，其余均造模，采用一次性的腹腔注射環磷酰胺(120 mg/kg)聯合皮內注射白消安(12 mg/kg)制造大鼠卵巢早衰模型[13]。注射結束后，每天上午9：00～10：00取大鼠陰道脫落細胞，置于顯微鏡下觀察動情周期變化，若出現動情周期紊亂、動情間期延長、動情期消失等現象即為造模成功[14]。

1.3 動物實驗 所有大鼠造模成功后同時給藥，按照TFSC低、中、高劑量組(35、70、140 mg/kg)灌胃，正常組和模型組均給予同體積的0.9%NaCl注射液。雌激素對照組給予雌二醇溶液(0.3 mg/kg)灌胃。灌胃給藥10 d后處死所有大鼠，稱重，剖腹取出卵巢，取血清于-20 ℃冰箱保存。

1.4 觀察指標

1.4.1 動情周期的觀察 采用陰道脫落細胞涂片觀察大鼠的動情周期，用消毒棉簽插入大鼠陰道約0.5 cm，輕輕轉動2～3圈，均勻涂在潔凈的載玻片上，巴氏染色后，顯微鏡下觀察。觀察標準如下。①動情前期：絕大多數細胞為橢圓形的有核上皮細胞。②動情期：鏡下絕大多數細胞為片狀無核角化細胞。③動情后期：鏡下主要為白細胞、有核上皮細胞、片狀角化細胞。④動情間期：鏡下絕大多數細胞為白細胞[15]。

1.4.2 性激素水平 取大鼠血清采用化學發光法進行雌二醇、卵泡刺激素測定。

1.4.3 卵巢指數 取出卵巢后，采用電子天平稱重并計算卵巢指數[16]。卵巢指數=卵巢濕重(mg)/體重(g)×100%。

1.4.4 病理形態學觀察和卵泡計數 ①取大鼠卵巢，用10%甲醛溶液浸泡固定后進行組織脫水、透明、浸蠟、包埋后制成蠟塊保存；②將組織塊切成 3～4 μm石蠟切片，進行常規蘇木精-伊紅染色法染色，顯微鏡下觀察卵巢的形態學變化；觀察卵泡發育，計數卵泡數量。

2 結 果

2.1 TFSC對卵巢早衰大鼠動情周期的影響 除正常組，模型組、雌激素對照組及TFSC低、中、高劑量組大鼠的動情周期均發生紊亂，其中模型組表現為持續延長的動情間期、無動情前期或動情期。正常組、雌激素對照組及TFSC低、中、高劑量組的動情期分別為4～5 d、5～6 d、7～8 d、6～7 d、5～6 d。

2.2 TFSC對卵巢早衰大鼠性激素水平的影響 各組大鼠的雌激素水平均不同程度的降低，其中模型組、TFSC低劑量組低于正常組(P<0.05)，雌激素對照組及TFSC中、高劑量組雌二醇水平高于模型組(P<0.05)；各組大鼠卵泡刺激素水平均有不同程度的降低，其中，模型組、雌激素對照組及TFSC低、中、高劑量組卵泡刺激素水平低于正常組，TFSC低劑量組低于模型組(P<0.05)。見表1。

2.3 TFSC對卵巢早衰大鼠卵巢指數的影響 各組大鼠體重、卵巢指數比較差異有統計學意義(P<0.05)，與正常組比較，模型組及雌激素對照組及TFSC低、中、高劑量組的體重、卵巢指數均降低(P<0.05)，但與模型組比較,TFSC高劑量組大鼠體重、卵巢指數均升高(P<0.05)，與雌激素對照組比較，TFSC低劑量組體重升高(P<0.05)。見表2。

組別只數雌二醇(pg/mL)卵泡刺激素(mU/mL)正常組1595.21±21.120.036±0.003模型組1554.87±25.05a0.026±0.002a雌激素對照組1578.87±30.04b0.025±0.003aTFSC低劑量組1565.61±27.61ab0.023±0.001abTFSC中劑量組1569.83±23.93b0.026±0.002aTFSC高劑量組1579.92±26.11b0.027±0.003aF值4.33951.420P值0.002<0.001

TFSC：菟絲子總黃酮；a與正常組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05

組別只數體重(g)卵巢指數(×10-1)正常組15263.65±5.183.88±0.17模型組15232.23±4.15a2.87±0.13a雌激素對照組15257.12±3.37a3.15±0.19aTFSC低劑量組15255.22±4.02ac3.24±0.21aTFSC中劑量組15256.61±3.78a3.36±0.18aTFSC高劑量組15258.11±3.69ab3.54±0.15abF值108.57056.451P值<0.001<0.001

TFSC：菟絲子總黃酮；a與正常組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05；c與雌激素對照組比較，P<0.05

2.4 各組大鼠的卵巢組織形態學及卵巢中卵泡計數比較 顯微鏡下觀察，正常組(圖1a)卵巢體積大，卵泡生長活躍，可見各級卵泡分布，顆粒細胞層次多；黃體發育好，黃體細胞豐富。模型組(圖1b)卵巢萎縮明顯，卵泡數量減少，閉鎖卵泡數量增多，卵泡顆粒細胞層減少，黃體數量減少。雌激素對照組(圖1c)及TFSC低、中、高劑量組(圖1d～f)卵巢體積較模型組大，卵巢皮質內可見大量初級卵泡及生長卵泡，較多接近成熟卵泡，顆粒細胞層次多，黃體發育細胞較多。以用藥高劑量組最為明顯。各組大鼠總卵泡數、生長卵泡、閉鎖卵泡/總卵泡比較差異均有統計學意義(P<0.05)，模型組、雌激素對照組及TFSC低、中、高劑量組總卵泡數少于正常組，雌激素對照組及TFSC中、高劑量組多于模型組(P<0.05)；模型組、雌激素對照組及TFSC低、中劑量組生長卵泡少于正常組，雌激素對照組及TFSC中、高劑量組多于模型組(P<0.05)；雌激素對照組及TFSC低、中、高劑量組閉鎖卵泡/總卵泡低于模型組(P<0.05)。見表3。

a：正常組； b：模型組； c：雌激素對照組； d：TFSC低劑量組；e：TFSC中劑量組； f：TFSC高劑量組；→：生長卵泡；▲：黃體；△：閉鎖卵泡；TFSC：菟絲子總黃酮

圖1 各實驗組大鼠卵巢組織形態圖(蘇木素-伊紅染色，×100)

3 討 論

對病因不同的卵巢早衰患者,臨床普遍使用激素替代療法進行治療，而卵巢早衰患者大多伴有生育問題，對有生育要求的患者，如何改善提高卵巢功能已成為一個迫切需要解決的問題。近年來，中醫藥對卵巢早衰的治療也取得很大進展，中醫在辨證治療上從肝腎入手,兼及氣血、痰濕等,促進性腺軸正常功能的恢復,提高卵巢功能,防止卵巢組織出現病理性改變,使性激素達到平衡[17]。張立[18]應用補腎劑治療36例卵巢早衰患者,結果顯示患者的雌激素缺乏癥狀明顯減輕,有的甚至消失,生殖器萎縮得到有效改善,其中1例妊娠。進一步說明采用中醫藥治療能從根本上恢復臟腑、沖任的功能,從而使機體達到陰陽平衡，臟腑和諧,氣血旺盛，進一步恢復性腺軸功能,使卵巢功能早衰現象得到改善。

組別只數總卵泡數(個)生長卵泡(個)閉鎖卵泡/總卵泡正常組1529.15±3.5122.89±4.190.21±0.07模型組1512.34±3.78a7.68±3.56a0.39±0.06雌激素對照組1525.88±3.23ab18.76±3.15ab0.25±0.09bTFSC低劑量組1518.92±3.19a13.69±4.10a0.30±0.03bTFSC中劑量組1522.97±3.54ab15.92±3.79ab0.28±0.09bTFSC高劑量組1524.74±3.49ab17.81±3.46b0.24±0.04bF值44.23428.70513.158P值<0.001<0.001 <0.001

TFSC：菟絲子總黃酮；a與正常組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05

中藥菟絲子是常用的補腎中藥，在臨床上用單味中藥菟絲子治療性腺功能障礙也取得顯著療效[19-20]。研究發現菟絲子對下丘腦-垂體-性腺軸功能有多方面的作用：促進下丘腦-垂體促性腺功能的恢復,提高垂體及卵巢對激素的反應性，促進卵泡的發育，增強卵巢激素受體的數目與功能，具有類雌激素樣活性[21-22]。說明菟絲子能明顯改善生殖系統功能，尤其是提高卵巢功能。

本研究結果顯示，TFSC對卵巢早衰的大鼠動情周期有明顯的恢復作用，尤其是TFSC高劑量組大鼠動情周期與雌激素組基本無差別，說明TFSC有類雌激素樣的作用。血清學激素檢測也說明這一點，用藥組卵巢早衰大鼠體內雌激素水平和卵泡刺激素的水平均有明顯提高，這與其他研究結果[23]一致，說明TFSC能明顯恢復卵巢早衰大鼠的卵巢內分泌功能。TFSC低、中、高劑量組大鼠的體重和卵巢指數雖與正常組比較略有降低，但也明顯高于模型對照組，進一步說明TFSC能一定程度低恢復卵巢功能，且TFSC高劑量組療效最顯著。這也與臨床應用中藥菟絲子治療卵巢早衰取得療效的結果一致。

同時，通過對各實驗組大鼠卵巢組織的病理形態學觀察及卵泡計數結果也印證了這一結果。本研究結果顯示，模型組大鼠的卵巢明顯萎縮，卵泡數量減少，閉鎖卵泡增多，而雌激素對照組及TFSC低、中、高劑量組卵巢體積較模型組大，卵巢皮質內可見大量初級卵泡及生長卵泡，較多接近成熟卵泡，以TFSC高劑量組最為明顯。表明TFSC能明顯促進卵巢早衰大鼠卵巢的各級卵泡發育，尤其是促使優勢卵泡成熟化及顆粒細胞增殖，增加雌激素分泌，具有類雌激素樣的作用，對大鼠卵巢早衰有明顯的治療效果。

綜上所述，TFSC對大鼠卵巢早衰有明顯的療效，可以明顯提高大鼠血清雌激素水平，恢復卵巢早衰大鼠的動情周期，促進卵巢內卵泡發育及顆粒細胞增殖。為進一步開發和研究補腎中藥菟絲子在臨床治療卵巢早衰提供了一定的研究基礎。