代謝組學技術在肺癌早期診斷方面的研究進展

李 鑫，王 猛

(天津市胸科醫院胸外科，天津 300350)

肺癌是起源于呼吸道上皮細胞的惡性腫瘤，根據美國癌癥研究協會調查數據顯示， 2017年全球預計新增癌癥病例16.8萬，癌癥死亡60萬例，其中肺癌死亡人數占全部癌癥死亡總數的12%左右[1]。由于肺癌早期無特異性癥狀，患者在發現時已處于中晚期，影響療效和預后[2]。為提高肺癌的早期診斷率，增加患者生存率，迫切需要探尋一種高敏感性、高特異性、低創傷性的肺癌診斷方法[3-4]。代謝組學又稱代謝輪廓分析，通過對各種生物樣品中小分子化合物(分子量<1 000)的代謝產物進行定量測量和定性分析，監測不同代謝物的水平及變化，全面了解不同生物系統復雜的生理和病理狀態[5]。由于代謝標志物能夠敏感地反映機體的不同生理病理狀態，因此可通過分析肺癌患者與健康人的代謝輪廓得到肺癌特異性代謝產物，分析這些代謝產物在肺癌發生、發展過程中涉及的代謝通路有助于肺癌的早期診斷。雖然代謝組學已廣泛應用于各種惡性腫瘤的代謝組特征研究[6-8]、生物標志物的挖掘以及診斷模型的建立[9]，但將研究結論應用于臨床上肺癌的早期診斷還存在很多問題。現就代謝組學技術在肺癌早期診斷中的研究進展進行綜述，為尋找肺癌早期生物標志物和進行病因研究提供依據。

1 代謝組學技術

基因組學是從分子生物學水平研究疾病狀態下基因的排列、順序、數量等變化找出與疾病可能相關的基因。蛋白質組學則是從蛋白質水平研究疾病狀態下蛋白質水平、含量的變化，找出與正常生理狀態下相比表達有差異的蛋白質，作為潛在的生物標志物應用于疾病的診斷、治療和預后。與基因組學和蛋白質組學技術不同，代謝組學的研究對象是內源性代謝物質(中間或代謝終產物)，通過分析這些代謝物質在體液及組織內的變化規律，可以從生物整體分析基因表達，蛋白質調節等內外因素對機體狀態的影響[10]，機體內任何生理、病理或其他因素的變化都會影響代謝物的濃度或使代謝流發生改變[11]，因此代謝組學技術能更真實地反映機體的實際情況。目前主要的技術包括核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技術、液相色譜-質譜法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)技術等。NMR是第一個用于全面測量生物樣品中代謝物的分析平臺。這種技術具有許多優勢：①無損傷性；②可進行生理條件或模擬機體生理條件的體外實驗；③與特定干預手段相結合，研究不同動態系統中機體的化學交換、運動等代謝產物的變化規律；④實驗方法靈活，而且需要的樣本量較小[12]，被認為是代謝物結構分析的金標準[13]。目前，基于NMR的代謝組學技術已成功應用于尋找各種癌癥的生物標志物，包括前列腺癌、胃癌、腎癌、宮頸癌、口腔黏膜鱗狀細胞癌和其他癌癥[14-17]。另外，一些研究結果顯示了NMR在不同癌癥患病風險的預測[18-19]、早期診斷[20]和分期[17,21]等方面的應用。NMR的主要缺點是其化學位移有限，導出的圖譜中可能出現數百種化合物的峰，這些峰在圖譜中相互重疊、干擾，導致圖譜解析困難，因此NMR相對于LC-MS敏感性相對較低[22]。基于LC-MS的代謝組學技術具有較高的敏感性和特異性，能夠對代謝物進行定量分析，鑒別代謝物的化學分子結構。但LC-MS也具有局限性，并不是對所有的化合物都敏感。由于LC-MS技術沒有商業化的圖譜庫可以對比查詢，需要研究者建立圖庫或分析圖譜。為解決這一問題，氣相色譜-質譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、LC-MS等高敏感性和高分辨率的分析技術也被廣泛應用于不同腫瘤的代謝組學分析研究。

2 代謝組學技術與肺癌診斷

不同癌癥患者的癌細胞和組織基因組存在某些差異。由于癌細胞的異質性，許多基因和蛋白質診斷標志物的敏感性和特異性都大大降低，這些基因和蛋白質的標志物可能在一些患者中能有效識別腫瘤，而在另一些患者中無效[23]。腫瘤的發生、發展過程涉及機體的多個系統，代謝組學通過定性和定量的分析腫瘤發生、發展過程中的所有代謝產物，多角度地尋找肺癌的標志物，識別未知代謝產物，可以全面地反映機體的狀態[24]。雖然目前代謝組學在許多方面還不成熟，對肺癌發生發展的作用機制、代謝特征等認識不夠全面，但隨著研究目標的確定、研究方法的不斷完善和更新，代謝組學在肺癌的早期診斷方面得到很大發展。

2.1 呼氣代謝組學 揮發性有機化合物(volatile organic compounds,VOCs)是常溫下以蒸汽形式存在于空氣中的一類有機物的總稱[25]。血液中經肺代謝后排出的產物稱為內源性VOCs，而人體暴露于環境中，直接吸入肺部后呼出的稱為外源性VOCs[26]。內源性VOCs是人體內新陳代謝的產物，其濃度和成分的改變與人體的健康或疾病相關[27]。Pauling等[28]首次采用氣相色譜儀對人體呼出氣成分進行研究，并統計了200多種VOCs，發現其中一些VOCs與不同病理狀態存在相關性。Phillips等[29]采集肺癌患者和健康人的呼出氣樣本進行檢測，發現22種VOCs可以作為肺癌的生物標志物。O′Neill等[30]采集肺癌患者和健康人的呼氣樣本利用GC-MS進行檢測，發現28種以烷烴和苯的衍生物為代表的VOCs作為肺癌疑似生物標志物。Corradi等[31]采用固相微萃取法對肺癌患者、吸煙者、不吸煙者及健康人呼出氣進行采樣，進行GC-MS分析發現與吸煙者和非吸煙者相比，非小細胞肺癌患者呼出的空氣中戊烷、2-甲基戊烷、2,4-二甲基庚烷的含量更高；與肺癌組、不吸煙組及健康人組相比，吸煙者BTEX(苯、甲苯、乙苯和二甲苯)濃度較高，這些差異可以用來鑒別各種肺部疾病的特征指紋。Deng等[32]和Phillips等[33]對肺癌患者的呼氣用GC-MS技術進行分析發現與健康人相比，肺癌患者的呼氣中還有己醛和庚醛。Gaspar等[34]應用固相微萃取氣相色譜-飛行時間質譜技術對肺癌患者和健康人的呼氣代謝物組成進行分析，發現C14～C24直鏈和支鏈烷烴與肺癌相關性較強，能較靈敏地將化療肺癌患者與未治療的肺癌患者和健康人區分開。Bajtarevic等[35]用固相微萃取法和質子轉移反應質譜技術分析肺癌患者和健康人呼氣中的VOCs，確定醇、醛、酮、烴為肺癌潛在的標志物。Fuchs等[36]用頂空固相微萃取在線衍生化GC-MS對肺癌患者、吸煙者和健康人呼出氣中的C1～C10醛類有機物進行分析，發現戊醛、己醛、辛醛和壬醛在肺癌患者呼氣中的濃度更高。胡燕婕[37]對肺癌患者、良性腫瘤患者和健康人呼氣中的VOCs進行了系統分析，確定了29種特征性VOCs，以長鏈烷烴類及甲基化衍生物，醛、酮、醇等含氧有機物等為主。這些研究利用代謝組學技術對人體不同生理病理狀態下VOCs的成分進行檢測分析，得到了可用于肺癌早期鑒別診斷的可能代謝標志物，認可了VOCs在肺癌早期診斷方面的應用價值。但是由于缺乏統一的采樣標準和樣本儲存方法等，目前尚無商業化產物應用于臨床。

2.2 血液代謝組學 在代謝組學研究中，血液標本因其低成本、采集方便的獨特優勢而應用廣泛。Hori等[38]用GC-MS技術對29例健康人、33例早期和晚期肺癌患者的血清樣本進行代謝組學分析，發現23種代謝物的水平在肺癌組和健康組有顯著差異，不同病理分型(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)和不同病程(早期、晚期)的肺癌患者血清中代謝物水平和濃度具有特征性的變化。牛艷潔等[39]采用GC-MS技術對肺癌患者和其他肺部感染患者的血清小分子代謝物質進行分析，發現了13種差異代謝物。Miyamots等[40]用氣相色譜-飛行質譜技術分析了非小細胞肺癌和其他肺癌患者的血液樣本，發現甘油、乙醇胺、麥芽糖、棕櫚酸、谷氨酸和乳酸的濃度在非小細胞肺癌患者中明顯升高，而色氨酸、組氨酸和賴氨酸的濃度明顯降低。Chen等[41]運用液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術和GC-MS技術結合的方法對健康人和肺癌患者的血清進行分析發現，α-羥基異丁酸的含量在肺癌患者中升高，而硫酸普拉睪酮和2，3，4-三乙基丁酸的含量降低。Musharraf等[42]采用GC-MS技術對肺癌患者、慢性阻塞性肺疾病患者、健康吸煙者和健康不吸煙者的血漿進行分析發現，肺癌患者血漿中脂肪酸、葡萄糖和酸的水平較其他組均升高。田舍等[43]利用核磁共振氫譜檢測肺癌和正常體健者血清中小分子代謝產物，發現肺癌患者血清丙氨酸、谷氨酸鹽、丙三醇、蘇氨酸以及異亮氨基酸可能成為原發性肺癌的診斷標志物。腫瘤在肺部的生長過程中攝取了血清中大量的能量，機體通過增加有氧氧化途徑中“原材料”來保證其他器官的正常能量代謝，出現糖代謝增強和脂肪代謝的減弱，一些氨基酸代謝相關的酶的代謝狀態也發生改變，導致氨基酸異常表達。上述研究通過不同的代謝組學方法發現了不同的潛在肺癌診斷標志物，通過對相應物質進行進一步的代謝通路研究，可對肺癌在早期做出診斷和治療，延長患者的生存期。

2.3 組織代謝組學 由于不同個體之間差異較大，不同病理類型的肺癌對血液中代謝物濃度的影響也較大，與血液標本相比，組織標本受外界因素影響較小，組織代謝物代表的是不同組織和器官的總變化水平。隨著生物科學技術的不斷進步，利用代謝組學技術從組織樣本中篩選腫瘤潛在生物標志物已經取得快速發展。Wu等[44]對肺癌組織和正常肺組織中的代謝產物采用LC-MS技術進行分析，發現279肽和90肽為可能的肺癌生物標志物，并最終驗證了一個12肽的標志物。與正常組織相比，該標志物在肺癌組織中的豐度更高。Jordan等[45]對肺癌患者和健康人的肺組織進行分析發現，在肺癌組織中乳酸、磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿的濃度升高，葡萄糖、肌醇和乙酸的濃度下降。陳文學等[46]以肺癌患者不同部位(腫瘤邊緣、腫瘤中心和腫瘤實質)的組織萃取液進行代謝組學分析，發現與鄰近非侵入肺組織相比，肺癌組織中乳酸含量顯著升高，而肌醇、谷氨酰胺和纈氨酸的含量顯著下降。Rocha等[47]用NMR技術對鱗癌和腺癌患者的癌組織進行分析，發現牛磺酸、尿苷核苷酸水平在腺癌組織中顯著升高，而肌酸、谷胱甘肽在鱗癌組織中顯著升高，這些差異代謝物對腺癌和鱗癌的區分度可達94%。Mathé等[48]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術對肺癌患者與健康者的癌組織及癌旁組織樣本進行代謝組學分析，發現肌酸核苷與N-乙酰神經氨酸的濃度在癌組織中顯著增加，提示它們可用于肺癌的早期診斷和預后評判。組織作為臨床上診斷肺癌的金標準，但由于獲取較困難，不利于作為肺癌早期篩查手段進行推廣，在后續的研究中可將其結果與其他樣本代謝組學結果結合，互相驗證，探索敏感性高、特異性強的肺癌早期診斷生物標志物。

2.4 尿液代謝組學 與其他標本相比，尿液標本具有獲得便捷、無創的特點，更易被大眾所接受。與血液標本相同，尿液也包含許多因為發生肺癌而改變的代謝信息，另外，尿液經過腎小球過濾后，可以使氨基酸、有機酸等成分得到濃縮，方便檢測，是代謝組學分析中最典型的生物樣本。牛艷潔等[39]用GC-MS技術對肺癌患者和其他肺部疾病患者的尿液小分子代謝物質進行代謝組學研究，確定了7種差異代謝物。許國旺等[49]對肺癌患者和健康人尿液中核苷酸含量進行研究發現，與健康人相比，肺癌患者尿液中13種核苷酸明顯升高。王文昭等[50]對肺癌患者與健康者尿樣中修飾核苷代謝輪廓譜采用二維液相色譜在線分析系統結合最小二乘判別分析法進行了分析，初步鑒定出具有顯著變化的修飾核苷。An等[51]采用大氣壓光離子化、大氣壓化學離子化和電噴霧離子化3種電離方式的“組合式”分析方法結合多變量生物信息學數據處理方法，對肺癌患者與健康人的尿液進行代謝組學分析，鑒定出11個代謝物在肺癌患者尿液中濃度明顯增高。Yang等[52]對肺癌患者與健康志愿者的尿液進行分析，在肺癌患者尿液中鑒定出11個以氨基酸及其代謝產物為主發生上調的代謝物結構。Carrola等[53]采用核磁共振氫譜技術對肺癌患者與健康者尿液中的小分子化合物進行了代謝組學分析，發現馬尿酸鹽和葫蘆巴堿在肺癌患者尿液中含量顯著降低，而肌酐、ɑ-羥基異丁酸、β-羥基異戊酸、N-乙酰谷氨酷胺的含量顯著升高。

2.5 細胞代謝組學 由于血液和尿液等生物樣本容易受飲食、環境、年齡和其他疾病等因素干擾，而以腫瘤細胞為研究對象，通過研究不同細胞代謝物的差異表達尋找潛在的生物標志物可以避免常規實驗中其他因素的干擾。Filipiak等[54]用GC-MS技術對肺癌細胞株CALU-1(人肺癌細胞系)和空白組上空的空氣成分進行分析，發現4種代謝物濃度在肺癌細胞株組升高，而部分醛類濃度降低，采集肺癌細胞株NCI-H2087和A549的培養液上方空氣進行分析，發現醇和甲基化烷烴的濃度明顯升高，而醛類和丁基酯的濃度有所下降，證明肺癌細胞在生長過程中可能會產生某些特定的揮發性有機物，同時也可能會消耗某些特定的揮發性有機物[55-56]。余欣尉等[57]用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術分別對肺癌細胞與正常細胞產生的極性代謝物和非極性代謝物進行了指紋圖譜分析，并采用生物信息學分析方法對代謝組學數據進行多維的統計學分析，發現腫瘤細胞存在異常的蛋白質、脂肪酸和磷脂代謝，并確定了31種對分類有貢獻的潛在小分子代謝標志物，證明通過研究細胞代謝物的差異表達尋找肺癌特征標志物是可行的、有前景的新手段，并可以與傳統以患者血液、尿液和組織為樣本的代謝組學研究相互佐證和補充，為研究肺癌的發病機制、預防和治療提供新思路和新方法。

2.6 其他 除以上幾種常見的生物樣本外，其他生物樣本也被學者采集進行研究。Wen等[58]采用LC-MS技術研究膽紅素水平與吸煙者肺癌的關系，結果發現膽紅素水平與男性吸煙者肺癌的發生率及病死率呈負相關，提示低水平的膽紅素可以作為男性吸煙者發生肺癌的潛在預警標志物。Callejón-Leblic 等[59]收集肺癌患者與健康者的支氣管肺泡灌洗液，采用GC-MS代謝組學技術分析結合生物信息學分析方法，建立偏最小二乘判別分析模型，經進一步的代謝通路分析發現左旋肉堿、膽堿、磷酸、甘油、腺嘌呤5種代謝物在肺癌患者中存在差異。

3 小 結

肺癌的發生、發展是一個漸進的過程，隨著生物學技術的不斷發展、肺癌基礎研究的不斷深入，更多的物質將被揭示出與肺癌的診斷、治療和預后的關系，為肺癌的診斷與治療提供新的研究思路和方向。代謝組學作為一門新興的學科，在分子水平輔助診斷肺癌，未來作為新技術應用于肺癌的診斷具有一定的應用前景。代謝組學和其他組學相結合是目前多組學研究的趨勢，在科學技術的推動下，通過整合代謝組學和其他組學(基因組學、轉錄組學、蛋白質組學等)的數據和資源，建立完善可靠的肺癌生物標志物數據庫，有利于提升對肺癌系統生物學的認識，從而能夠更全面和深刻地揭示肺癌生物調控網絡的復雜性。