環狀RNA在糖尿病中的研究進展

劉婷婷，張海東，王 靜，謝俊豪，金百翰，黃 勤※

(1.海軍軍醫大學長海醫院內分泌科，上海 200433； 2.解放軍72506部隊衛生隊，河南 駐馬店 463200)

環狀RNA(circular RNA,circRNA)是長鏈非編碼RNA家族的新成員，已成為近年來RNA領域的研究熱點。1976年，circRNA首次在植物類病毒中被發現[1]。最初研究者誤認為circRNA是線性RNA異常剪接的副產品[2]。隨著RNA測序技術的發展，circRNA被證實在不同的物種和不同的細胞系中存在，并發揮著重要的生物學作用。2012年，Salzman等[3]基于高通量測序技術報道了80余個circRNA，隨后科學家陸續發現了大量circRNA。有研究證實circRNA參與心血管、神經系統、內分泌系統和腫瘤等多種疾病的發生和發展[4]。由于表達廣泛和疾病調控作用，circRNA被認為是多種疾病的生物學標志物和潛在治療靶點。雖然circRNA相關研究日益增多，但其與糖尿病相關方面的研究較少。現結合國內外相關研究，對circRNA與糖尿病關系的研究進展進行綜述。

1 circRNA概述

1.1 circRNA的形成機制與分類 與線性RNA的標準剪切模式不同，circRNA是通過非經典剪接方式進行反向剪接而成，形成機制主要分為外顯子環化和內含子環化。外顯子環化存在兩種模型[5]：模型一為套索驅動環化即在前體信使RNA(pre-messenger RNA，pre-mRNA)轉錄過程中發生外顯子跳躍，進而形成套索結構，后者再通過自身剪接并切除內含子序列，最終形成一個circRNA；模型二為內含子配對驅動環化，是指在pre-mRNA中兩個相鄰的內含子通過堿基反向互補配對而形成套索結構后切除剩余內含子，從而形成circRNA。Zhang等[6]認為內含子環化亦可作為circRNA的形成機制，即5′端剪接位點富含7個鳥嘌呤(G)、尿嘧啶(U)核苷酸序列與3′端分支位點富含11個胞嘧啶(C)核苷酸序列共同構成核心保守序列，該序列可避免circRNA內含子套索結構被去分支酶降解，從而形成完整的 circRNA。此外，多種RNA結合蛋白均會影響 circRNA 的形成，如盲肌蛋白(muscle blind protein,MBL)和Quaking蛋白可促進circRNA形成，而作用于RNA的腺苷脫氨酶1則會對circRNA的形成產生抑制作用[7-8]。

由于circRNA可在基因組的任何區域形成，故可依據來源主要分為以下3類：①外顯子來源的circRNA，由外顯子序列組成，形成于外顯子編碼區，主要存在于細胞質[9]；②內含子來源的circRNA，由內含子序列組成，通常源于pre-mRNA剪切，主要存在于細胞核[6]；③外顯子-內含子共同來源的circRNA，由外顯子和內含子序列共同組成，即在circRNA的形成過程中環化外顯子之間滯留有未被切除的內含子，主要存在于細胞核[10]。

1.2 circRNA的生物學特征及功能

1.2.1 circRNA的生物學特征 隨著circRNA研究的逐步深入，目前報道其主要具有以下幾方面生物學特征。①分布廣泛且種類豐富：circRNA廣泛存在于多種真核生物且種類豐富。在人、鼠、酵母菌等多種真核細胞中已發現有10萬種以上circRNA[11-12]，且某些circRNA的表達水平甚至可達到同一基因來源的線性異構體10倍以上。②性質穩定且半衰期長：circRNA的結構呈首尾相接的封閉環狀，且不具備游離的5′端和3′端，使其不易被核酸外切酶RNase R和分支酶降解，故具有更穩定的生物學特性[6]。研究發現大部分circRNA的半衰期均大于48 h，遠大于線性mRNA 10 h左右的半衰期[13]。③高度保守性：大多數物種具有高度保守性的circRNA序列。Werfel等[14]在研究人類、大鼠和小鼠的心肌細胞中發現，其具有高度保守性的circRNA 序列含量可達10%左右。④時空特異性：circRNA在不同的組織器官或同一組織器官的不同發育時期，其種類和表達量具有顯著差異，即circRNA在生物發展過程中常表現為組織特異性和發育階段特異性。Salzman等[15]研究發現在乳腺癌細胞系MCF-7中觀察到胞質分裂貢獻者1基因可高表達circRNA，而在肺癌細胞系A549中則呈低表達甚至無表達。同樣，Pan和Xiong[16]發現在線蟲的卵母細胞有circRNA存在，而在其早期的胚胎細胞中未發現。

1.2.2 circRNA的生物學功能 circRNA的功能主要包括circRNA的海綿樣吸附作用、調控基因轉錄作用、與RNA結合蛋白相互作用以及參與翻譯生成蛋白質4個方面。

1.2.2.1 circRNA的海綿樣吸附作用 微RNA(microRNA,miRNA)是一類具有調控作用的非編碼RNA，可通過堿基互補配對的方式遏止靶基因mRNA翻譯或促進靶基因mRNA降解，參與調控機體的發育過程。circRNA含有miRNA結合位點，可作為競爭性內源RNA，類似“海綿”高效吸附相應的miRNA，從而減少miRNA對其靶基因mRNA的抑制，促進靶基因的表達。小腦變性相關蛋白1反義轉錄物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as),又被稱為miR-7的circRNA海綿包含了至少70個miR-7的結合位點。在人和小鼠腦組織中，CDR1as高表達時可通過競爭性結合吸附miR-7進行負向調控，間接導致miR-7靶基因的表達水平提高；反之，CDR1as低表達時則會導致miR-7靶基因表達水平降低[11]。與CDR1as不同，研究者發現來自同源域相互作用蛋白激酶3(Homo sapiens homeodomain interacting protein kinase 3，HIPK3)基因外顯子2的circHIPK3可作為多種miRNA的“海綿”[17]。雖然很多研究證實了海綿效應，但也有研究發現大多數circRNA不起miRNA海綿作用[18]。

1.2.2.2 調控基因的轉錄作用 circRNA可通過順式調控作用影響相關基因的轉錄。ciRNA通過結合RNA聚合酶Ⅱ復合體，正向調節該酶的轉錄活性，從而促進其親本基因表達[6]。外顯子-內含子共同來源的circRNA可與U1小核核糖核蛋白結合形成外顯子-內含子共同來源的circRNA-U1小核核糖核蛋白復合體，該復合體通過結合RNA聚合酶Ⅱ從而發揮順式調控作用促進其基因轉錄[19]。研究發現circRNA也可作為反轉錄的轉座子介導產生假基因，調控基因表達[20]。

1.2.2.3 與RNA結合蛋白相互作用 circRNA還可通過與多種RNA結合蛋白結合，形成RNA蛋白復合物，進而發揮其生物學作用。如circ-Foxo3能通過結合人DNA結合蛋白抑制劑1、抗應激蛋白局部黏著斑激酶及人低氧誘導因子1α等多種蛋白，抑制其抗衰老和抗應激作用，從而導致細胞衰老[21]。circ-Foxo3還能與細胞周期蛋白依賴性激酶2和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(p21)相互作用，形成circ-Foxo3-細胞周期蛋白依賴性激酶2-p21三元復合物，抑制細胞周期進程[22]。Ashwal-Fluss等[23]研究發現MBL可環化形成circMBL，后者可通過其內含子的MBL結合位點與MBL相互作用，抑制生成MBL mRNA而降低MBL蛋白水平。

1.2.2.4 參與翻譯生成蛋白質 傳統觀點認為circRNA是非編碼RNA。但近年來有大量報道顯示circRNA也具有翻譯生成蛋白質的功能[24-26]。Chen和 Sarnow[24]研究發現circRNA含有內部核糖體進入位點時，真核細胞核糖體就能啟動翻譯。如丁型肝炎病毒的單鏈circRNA能夠翻譯出與病毒相關的蛋白，且與肝炎的發生、發展密切相關[25]。此外，circRNA還通過滾環擴增的機制翻譯蛋白且增加其表達水平[26]。

2 circRNA與胰島β細胞

胰島β細胞功能受損是2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)發病的重要機制之一。研究發現miR-7可在胰島β細胞中過表達，并且通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路損傷胰島β細胞的去分化功能，抑制胰島β細胞增殖，減少胰島素的分泌，從而誘發糖尿病[27]。Hansen等[11]認為CDR1as過表達時可通過海綿樣吸附miR-7而負向調控miR-7，阻礙miR-7對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路的抑制作用，刺激胰島β細胞增殖，使胰島素分泌水平增加。Xu等[28]利用毛喉素和佛波酯長期刺激胰島β細胞使CDR1as含量增加，抑制miR-7活性并上調miR-7的靶基因Pax6和Myrip的表達，而兩者可增強胰島素基因轉錄并調節胰島素顆粒運輸，促使胰島素分泌水平增加，提示CDR1as/miR-7可能成為治療糖尿病的新靶點。Stoll等[29]運用微陣列方法檢測糖尿病模型小鼠的胰島β細胞中circRNA的表達水平及其作用機制，結果顯示circHIPK3在小鼠的胰島中表達下調，并導致β細胞擴增減少和胰島素分泌降低，其機制可能與circHIPK3通過競爭性結合miR-338-3p和miR-124-3p以及調控β細胞關鍵基因(葡萄糖轉運體2、肌侵蛋白和蛋白激酶B1)的表達有關，而上述這些miRNA可能在胰島β細胞發育、增殖和功能中發揮重要作用。由此表明，circHIPK3可能是調節胰島β細胞功能活性的新分子。Kaur等[30]發現β細胞中顯著上調的circRNA包括轉化生長因子-βⅢ型受體和組蛋白去乙酰化酶9，其中轉化生長因子-βⅢ型受體因子參與編碼轉化生長因子-βⅢ型受體，而轉化生長因子-β信號轉導可誘導人胰島和成年小鼠的β細胞復制，提示circRNA在調節胰島β細胞的功能中起重要作用。

3 circRNA與糖尿病的相關研究進展

我國糖尿病患者約有4 000萬，其中T2DM約占90%[31-32]。T2DM是由于胰島素分泌絕對或相對不足，或者靶細胞對胰島素敏感性降低，造成糖代謝紊亂的一種慢性綜合性疾病，其晚期發生并發癥的概率較高，極易出現心腦血管病變、視網膜病變、末梢神經炎及糖尿病腎病等多種疾病。circRNA在糖尿病并發癥的發生、發展過程中有重要作用，可能作為糖尿病診斷與治療的潛在生物標志物。

3.1 circRNA與糖尿病并發癥的關系

3.1.1 circRNA與糖尿病心腦血管病變 糖尿病患者常伴有高血壓、血脂紊亂等心腦血管病變的重要危險因素，與非糖尿病人群相比，糖尿病患者發生心腦血管疾病的風險明顯增加。糖尿病合并心腦血管病變主要是動脈粥樣硬化，如冠狀動脈粥樣硬化引起心肌梗死、心絞痛、心力衰竭和猝死；腦動脈硬化引起缺血性發作、腦梗死。研究發現circRNA與和T2DM患者的冠狀動脈疾病的發生具有最強的相關性，研究人員將研究對象分為T2DM患者、冠心病患者、T2DM合并冠心病患者3個試驗組和健康人群對照組，通過微陣列分析鑒定各組差異表達的40個 circRNA，其中試驗組中13個circRNA表達上調，而27個circRNA表達下調，進一步篩選出顯著下調的Hsa_circ_11783-2并利用實時熒光定量聚合酶鏈反應進行驗證，結果顯示Hsa_circ_11783-2與T2DM患者冠狀動脈疾病的發生關系密切[33]。Zhou和Yu[34]報道circRNA_010567在糖尿病小鼠心肌中表達顯著上調，進一步研究表明circ RNA_010567/miR-141/轉化生長因子-β1通路在糖尿病小鼠心肌纖維化的過程中起重要調節作用。此外，Tang等[35]發現糖尿病小鼠心肌中表達上調的circRNA_000203，通過海綿吸附miR-26b-5p抑制其抗纖維化作用。

3.1.2 circRNA與糖尿病微血管病變

3.1.2.1 circRNA與糖尿病視網膜病變 微血管病變是糖尿病的特異性并發癥，可累及全身各組織器官，其中以糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病尤為重要。目前有關circRNA與糖尿病微血管病變的研究集中在糖尿病視網膜病變。Zhang等[36]研究證實Hsa_circ_0005015在糖尿病視網膜病變患者的血漿、玻璃體標本和視網膜內皮血管膜中的表達明顯上調，并通過吸附miR-519d-3p抑制其功能，從而上調相關靶基因基質金屬蛋白酶-2、細胞X連鎖凋亡抑制蛋白和轉錄活化子3的表達。Shan等[37]研究發現糖尿病視網膜和視網膜內皮細胞中circHIPK3顯著上調，其機制可能是circHIPK3抑制miR-30a-3p活性，調節下游基因血管內皮生長因子C、卷曲蛋白4 和WNT2來影響糖尿病性視網膜病變，故認為抑制circHIPK3可能減少視網膜毛細血管滲漏和炎癥，改善視網膜血管功能障礙，表明circHIPK3是減輕糖尿病相關視網膜病變的潛在治療靶點。此外，研究人員首次揭示了高糖誘導的血管平滑肌細胞的表達譜，并發現circWDR77/miR-124-成纖維細胞生長因子2 調節通路在血管平滑肌細胞增殖和遷移中起作用，為糖尿病微血管病變提供了新的理論依據[38]。

3.1.2.2 circRNA與糖尿病腎病 我國20%～40%的糖尿病患者合并糖尿病腎病，現已成為慢性腎臟病和終末期腎病的主要原因[39]。Hu等[40]發現circRNA_15698/miR-185/轉化生長因子-β通路促進細胞外基質相關的蛋白質合成，為糖尿病腎病的發病機制提供了新思路。但circRNA與糖尿病腎病方面相關報道較少，需要進一步深入研究。

3.1.3 circRNA與糖尿病周圍神經病變 糖尿病周圍神經病變是最常見的糖尿病并發癥之一，臨床常表現為神經性疼痛，顯著降低了患者的生活質量。Wang等[41]研究發現circHIPK3在鏈脲菌素誘導的糖尿病大鼠血清和背根神經節中含量較高，并通過敲除糖尿病大鼠circHIPK3后發現白細胞介素-1β、白細胞介素-6、白細胞介素-12和腫瘤壞死因子-α的表達降低，大鼠神經性疼痛明顯緩解。進一步研究表明其機制可能是circHIPK3通過負向調節miR-124的表達發揮作用。研究人員通過鞘內注射circHIPK3 shRNA緩解糖尿病大鼠的神經性疼痛，并證明了該方法可能成為治療糖尿病神經性疼痛的手段之一。

3.2 circRNA與糖尿病的診斷的關系 研究表明，circRNA可作為潛在的生物學標志物，診斷和預測腫瘤、心血管疾病、內分泌代謝疾病和中樞神經系統等疾病[4]。Zhao等[42]通過微陣列技術分析對比健康人群和T2DM患者外周血中的circRNA水平，結果顯示兩組共有489個circRNA的表達存在差異，其中T2DM組有78個circRNA表達上調，411個circRNA表達下調，然后篩選出5個circRNA作為候選生物標志物進行驗證發現Hsa_circ_0054633具有作為前驅糖尿病和T2DM的診斷生物標志物的潛力。Fang等[43]研究發現circANKRD36在T2DM患者的外周血白細胞中高表達，推測其可能通過與miRNA(包括Hsa-miR-3614-3p、Hsa-miR-498和Hsa-miR-501-5p)相互作用參與T2DM的慢性炎癥相關途徑，提示circANKRD36可用于判斷T2DM患者是否存在潛在感染的生物標志物。

4 小 結

近年來circRNA是非編碼RNA家族的研究熱點之一，其多種生物學功能正逐漸被人們所認知。盡管越來越多的研究認識到circrRNA在糖尿病的發生、發展中起關鍵的調節作用，但目前對circRNA與胰島β細胞和糖尿病的研究仍處于探索階段，其更深層次的生物功能及分子機制有待進一步揭示。相信隨著RNA高通量技術和分子生物學技術的不斷發展，對circRNA與糖尿病及并發癥發生、發展的關系將會有更加透徹的認識。circRNA也極有可能成為糖尿病診斷和預測的潛在生物標志物之一，有助于糖尿病的診斷、預后和精準治療。