慢性碘過(guò)量對(duì)大鼠下丘腦Ⅱ型脫碘酶及血清促甲狀腺激素釋放激素水平的影響

杜信，姜雅秋，孫瑩

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110001）

碘是甲狀腺激素合成中不可或缺的元素。缺碘對(duì)人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，使用碘化鹽為世界范圍內(nèi)預(yù)防碘缺乏的常規(guī)策略［1-2］。然而，隨著含碘鹽在世界范圍的常規(guī)化，已有大量研究［3-5］報(bào)道碘攝入過(guò)量現(xiàn)象已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)。流行病學(xué)研究［6］表明，正常人群中血清促甲狀腺激素 （thyroid-stimulating hormone，TSH） 水平升高，并且這與碘攝入量增加相關(guān)。因此，積極探索碘過(guò)量對(duì)甲狀腺功能的影響機(jī)制具有潛在的臨床價(jià)值。下丘腦-垂體-甲狀腺軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)是維持血清甲狀腺激素水平穩(wěn)定性的最重要機(jī)制［7］。目前普遍認(rèn)為，由下丘腦室旁核神經(jīng)元釋放的促甲狀腺激素釋放激素 （thyrotropin releasing hormone，TRH） 是參與調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-甲狀腺軸的重要分子，進(jìn)而影響甲狀腺功能。碘化甲狀腺激素脫碘酶 （脫碘酶） 是一種硒蛋白酶，在調(diào)節(jié)甲狀腺功能方面起到十分重要的作用［8］。廣泛分布于下丘腦中的Ⅱ型脫碘酶 （deiodinase type 2，D2） 能夠促進(jìn)無(wú)活性的甲狀腺素T4向有活性的T3轉(zhuǎn)化，進(jìn)而調(diào)控下丘腦-垂體-甲狀腺軸［9］。D2表達(dá)也受到泛素化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解機(jī)制的重要調(diào)節(jié)，分別通過(guò)直接失活和抑制D2從頭合成來(lái)降低D2活性［9-11］。為了闡明慢性碘過(guò)量對(duì)甲狀腺功能的影響機(jī)制，本研究檢測(cè)了慢性碘過(guò)量對(duì)大鼠下丘腦D2及血清TRH水平的影響，并探討了大鼠下丘腦D2及血清TRH水平的相關(guān)性，為科學(xué)補(bǔ)碘提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取180只4周齡Wistar大鼠 （購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司） ，雌雄參半，隨機(jī)分為對(duì)照組和3倍、6倍、l0倍、50倍高碘組，分別給予雙蒸水和濃度為277、692、1 245、6 788 μ g/L的碘溶液合并普通飼料喂養(yǎng)4、8、12、24周。根據(jù)體質(zhì)量將大鼠麻醉，腹部切開(kāi)并采集心臟血，在離心機(jī)中離心20 min以分離血清，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。從心臟收集血液后用100～200 mL生理鹽水灌流，處死大鼠，取出腦組織，迅速置于-40 ℃干冰中30 s后，放置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

碘化鈉、10%水合氯醛 （北京化學(xué)試劑公司） ，TRH試劑盒 （武漢華美生物公司） ，辣根酶標(biāo)二抗、DAB染色液 （中杉金橋公司） ，D2一抗ab77481 （英國(guó)Abcam公司） ，丙酮 （生工生物工程上海股份有限公司） 。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠血清TRH水平檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)，依據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)中所示步驟進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所進(jìn)行。

1.3.2 大鼠下丘腦D2水平檢測(cè)：腦組織在下丘腦室旁核水平面上切成10 μ m的冰凍切片，4 ℃冷丙酮固定。PBS沖洗3次，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷，PBS沖洗3次，一抗孵育24 h，PBS沖洗3次，二抗溫育20 min，PBS沖洗3次，DAB顯色2 min，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。用機(jī)器拍攝照片，使用圖像分析軟件Image Pro Plus定量檢測(cè)冰凍切片染色的結(jié)果。放大10倍，測(cè)量各組大鼠下丘腦第三腦室周圍陽(yáng)性染色的累積光密度。實(shí)驗(yàn)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌研究所進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清TRH水平

4周時(shí)，與對(duì)照組相比，10倍、50倍高碘組血清TRH水平分別下降了0.36及0.34倍 （P ＜ 0.05） ；8周時(shí)，6倍、50倍高碘組與對(duì)照組相比分別下降了0.18及0.34倍 （P ＜ 0.05） ；12周時(shí)，6倍高碘組與對(duì)照組相比下降了0.17倍 （P ＜ 0.05） ；24周時(shí)，3倍、50倍高碘組與對(duì)照組相比分別下降了0.98及0.71倍 （P ＜ 0.05） 。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠下丘腦D2水平

冰凍切片的免疫組化染色顯示，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各高碘組大鼠下丘腦D2水平較對(duì)照組均有所增加。見(jiàn)圖1～2。

表1 各組大鼠血清TRH水平 （pg/mL）Tab.1 Serum TRH levels of rats in each group （pg/mL）

圖1 大鼠下丘腦冰凍切片D2免疫組化染色照片 ×10Fig.1 Hypothalamic frozen sections D2 immunohistochemical staining in rats ×10

圖2 各組大鼠下丘腦D2蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of D2 protein in the hypothalamus of rats in each group

3 討論

T3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和生理功能中發(fā)揮著重要作用，80%的大腦皮層在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中使用T3。然而，人體血液中的甲狀腺激素主要以T4的形式存在［12］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，通過(guò)脫碘酶D2將T4轉(zhuǎn)化為T(mén)3是腦中T3的主要來(lái)源。因此，D2對(duì)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)中甲狀腺激素水平相對(duì)穩(wěn)定起著重要作用。盡管隨著碘濃度的變化，垂體D2的活性迅速而明顯地變化，但是對(duì)于該條件調(diào)節(jié)下丘腦D2的定量分析鮮有研究報(bào)道。

D2在人體和大鼠的不同位置被發(fā)現(xiàn)，通常在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，在人體甲狀腺、棕色脂肪以及胎盤(pán)中也有發(fā)現(xiàn)。D2活性主要隨著甲狀腺功能的改變而改變，甲狀腺功能減退癥時(shí)垂體脫碘酶活性下降［7］。早期研究［13］表明，甲狀腺功能減退大鼠循環(huán)中的T3恢復(fù)正常而不干預(yù)T4時(shí)，下丘腦室旁核表達(dá)的TRH mRNA水平不會(huì)恢復(fù)正常。因此，研究人員認(rèn)為T(mén)3周期中T4轉(zhuǎn)化參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制［14］，在一定程度上減少了腦中重要激素的波動(dòng)聯(lián)系。

下丘腦D2主要在伸長(zhǎng)細(xì)胞中表達(dá)［9］。第三腦室伸長(zhǎng)細(xì)胞位于正中隆起和側(cè)壁之間的選擇性雙向運(yùn)輸路徑上，特別是間質(zhì)細(xì)胞、血液和腦脊液。D2 mRNA主要存在于腦中伸長(zhǎng)細(xì)胞胞內(nèi)，延伸到第三腦室，最終進(jìn)入促垂體區(qū)域的TRH細(xì)胞中，從血液和腦脊液借由伸長(zhǎng)細(xì)胞短突起攝取T3并進(jìn)入下丘腦相應(yīng)區(qū)域中。T4通過(guò)脫碘產(chǎn)生的T3被這種方法轉(zhuǎn)移到TRH神經(jīng)元中，從而影響TRH的釋放［15］。最近研究［16］發(fā)現(xiàn)，伸長(zhǎng)細(xì)胞中的焦谷氨酰肽可以降解下丘腦產(chǎn)生的TRH，影響TRH釋放的濃度水平。

本課題組之前的研究［17］由過(guò)量碘引起的TSH升高得出結(jié)論：Wistar大鼠垂體TSH β mRNA表達(dá)上調(diào)，Wistar大鼠垂體TSH β蛋白增加。本研究結(jié)果顯示，碘過(guò)量會(huì)增加D2在下丘腦中的表達(dá)，導(dǎo)致T4更多的轉(zhuǎn)化為T(mén)3。T3經(jīng)由MCT8轉(zhuǎn)運(yùn)體及伸長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)入室旁核的促垂體區(qū)域及合成TRH細(xì)胞區(qū)域內(nèi)，抑制了下丘腦TRH的產(chǎn)生，進(jìn)而降低了外周血清TRH表達(dá)水平，即大鼠下丘腦D2水平與血清TRH表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。盡管在垂體中D2活性降低，使T3和T4的轉(zhuǎn)換減少，導(dǎo)致T3對(duì)TSH的抑制作用減弱，最終導(dǎo)致TSH增加。但是在下丘腦中，碘過(guò)量使伸長(zhǎng)細(xì)胞中的D2表達(dá)增加，增加了T3和T4的轉(zhuǎn)換，T3對(duì)TRH的抑制作用增加，TRH降低。根據(jù)本研究可以推斷，垂體水平TSH的升高不來(lái)源于下丘腦的TRH調(diào)節(jié)。然而，由于外周血中的TRH不僅來(lái)源于下丘腦，在伸長(zhǎng)細(xì)胞中T3的運(yùn)輸依賴于MCT8調(diào)節(jié)，而伸長(zhǎng)細(xì)胞表達(dá)的焦谷氨酰肽又能降解正中隆起釋放的TRH，所以在碘過(guò)量致血清TRH下降的過(guò)程中，是否受到其他分子的干預(yù)及影響尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，慢性碘過(guò)量可引起大鼠下丘腦D2表達(dá)水平增加及血清TRH水平降低，但該過(guò)程的具體機(jī)制有待繼續(xù)探究，積極探討慢性碘過(guò)量對(duì)甲狀腺功能的影響機(jī)制對(duì)臨床上科學(xué)補(bǔ)碘存在新的提示。