LC3在成釉細胞瘤中的表達及意義

黃碧瑩，劉潔，鐘鳴，，王珺婷，王小玢，康媛媛，孫妍，喬雪

（中國醫科大學 1. 附屬口腔醫院病理科，沈陽 110002； 2. 科學實驗中心，沈陽 110122； 3. 附屬口腔醫院中心實驗室，沈陽 110002）

成釉細胞瘤是牙源性腫瘤中最常見的上皮源性腫瘤，其術后易復發且具有局部侵襲性生長的生物學特性。成釉細胞瘤的病因及局部侵襲性表現的分子生物學機制尚不明確，目前的主要治療方法為手術切除，但術后易復發，且有惡變的可能，為治療帶來難度，并嚴重影響患者的生存質量［1］。因此，深入研究該腫瘤的發生發展機制，探索新的早期診斷和治療方法具有重要意義。

細胞自噬是真核細胞處理自身產生的衰老、損傷或變性的蛋白及細胞器等生物大分子的一種現象，能使這些來源于細胞自身的成分在溶酶體內降解或再利用，這一過程的目的不僅僅是清除細胞自身產生的廢物，更是作為一種動態循環系統，為細胞更新修復和維持動態平衡提供能量［2］。在自噬體形成過程中，微管相關蛋白1輕鏈3 （microtubule-assaiated protein 1 light chain 3，LC3） 分子由水溶形式的LC3-Ⅰ轉化為脂溶形式的LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ可以和新形成的自噬體膜結合，并且一直結合到自噬體與溶酶體融合，因而LC3-Ⅱ常被作為細胞內自噬的標志物［3-4］，LC3表達水平可作為檢測腫瘤自噬水平的指標。細胞自噬作為一種細胞的正常代謝現象在腫瘤的發生發展中可起到抑制或促進的雙重作用［5］，而細胞自噬在成釉細胞瘤中發揮的作用尚不明確。本研究旨在通過免疫組織化學染色方法檢測成釉細胞瘤及正常口腔黏膜組織中LC3表達水平，分析LC3表達與患者臨床病理資料間的關系，研究細胞自噬在成釉細胞瘤發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集中國醫科大學附屬口腔醫院2015年至2016年手術切除的104例成釉細胞瘤石蠟標本，均經病理科確診。其中男60例，女44例，年齡6～88歲，平均36.96歲；原發病例94例，復發10例；實性型成釉細胞瘤83例，單囊型成釉細胞瘤12例，促結締組織增生型成釉細胞瘤3例，外周型成釉細胞瘤6例。選取20例正常口腔黏膜組織標本作為對照，取材于中國醫科大學附屬口腔醫院口腔外科門診智齒拔除術帶出的牙周黏膜組織。所有標本使用均經患者知情同意，本研究經醫院倫理委員會批準同意。

1.2 主要試劑及方法

1.2.1 主要試劑：一抗為兔抗人LC3多克隆抗體，購自英國Abcam公司，二抗為羊抗兔抗體，購自中國碧云天生物有限公司。SP 超敏試劑盒 （鼠/兔） 及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2 免疫組織化學染色：石蠟包埋標本常規4 μm厚切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法（SP三步法） 。常規脫蠟、水化、檸檬酸鹽高壓抗原修復，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性，一抗4 ℃過夜，LC3抗體工作濃度為1∶ 400，二抗37 ℃孵育30 min，DAB染色，蘇木精復染。陰性對照采用 0.01 mol/L PBS代替一抗。

1.2.3 結果評判：LC3陽性表達見于細胞質，為棕黃色顆粒，強陽性時細胞間質和細胞核中亦可見表達。每張切片在200倍下觀察，隨機選取3個視野，對每個視野均進行染色強度評分與陽性瘤細胞百分比評分。胞質無著色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；陽性瘤細胞占總細胞數的0～5%記0分，＞5%～25%記1分，＞25%～50%記2分，＞50%記3分。每張切片最終評分=染色強度評分×陽性瘤細胞百分比評分，1～3分為陰性 （-） ，4分以上為陽性。

1.3 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計數資料比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LC3在成釉細胞瘤組織和正常口腔黏膜組織中的表達

圖1 LC3在成釉細胞瘤中陽性表達 SP×200Fig.1 Positive immunohistochemical reactivity for LC3 in ameloblastomas SP×200

LC3主要表達于成釉細胞瘤上皮細胞細胞質，陽性率高時細胞核也有著色 （圖1） ，在正常口腔黏膜組織中陰性表達 （圖2） 。104例成釉細胞瘤組織中LC3表達陽性率為76.92% （80/104） ，顯著高于正常口腔黏膜組織 （10.00%，2/20） ，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。

圖2 LC3在正常口腔黏膜中陰性表達 SP×200Fig.2 Negative immunohistochemical reactivity for LC3 in normal oral mucosal tissues SP×200

2.2 LC3表達與成釉細胞瘤臨床病理資料的關系

成釉細胞瘤中LC3的表達在患者年齡、性別及是否復發方面的差異無統計學意義 （P ＞ 0.05） ，在病變部位方面，發生于下頜骨的成釉細胞瘤中LC3陽性表達率高于發生于上頜骨及牙齦的成釉細胞瘤，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。在病理分型方面，實性多囊型患者的LC3陽性表達率高于其他分型患者，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） 。見表1。

3 討論

細胞自噬是一種細胞的分解代謝過程。在壓力條件下，如缺氧、生長因子缺乏和代謝壓力等，細胞通過降解或再利用自身產生的變性蛋白質或細胞器成分而產生能量，以幫助細胞度過生存危機，適應壓力環境，可起到阻止細胞衰老和死亡的作用。越來越多的研究［6］發現，細胞自噬在口腔及全身腫瘤、神經退行性疾病、心臟疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病等的發生發展和治療中都發揮重要作用。

表1 LC3表達與患者臨床病理資料的聯系Tab.1 Association between LC3 expression and clinicopathological characteristics

研究表明，細胞自噬在牙發育過程中也發揮重要作用。YANG等［7］發現，在小鼠的牙胚發育過程中，自噬相關基因Beclin1主要定位于成釉器的細胞質，星網狀層、內外釉上皮層的細胞核中也有Beclin1的表達，Beclin1可能參與了牙發育過程中細胞自噬及凋亡的相互作用，并與牙形態形成及發育有關；還有研究［8］在鼠牙胚發育的過程中檢測到LC3，提示自噬可能與牙齒發育期間分化細胞的細胞增殖、分化和穩態維持有關。在牙源性角化囊腫中也檢測到自噬水平增高，且自噬相關基因Beclin1和細胞增殖標志物Ki-67的表達呈現明顯的相關性［9］，這種現象表明自噬可能與細胞增殖潛能增加有關，可能與牙源性角化囊性瘤細胞具有較強的增殖能力以及術后易復發的特點有關。

成釉細胞瘤是牙源性腫瘤，與牙的發育密切相關，可能起源于發育中的牙釉質器官、牙齒上皮細胞剩余部分、口腔上皮細胞的基底細胞［10］及牙源性囊腫的襯里上皮或被覆黏膜的殘留物［11］。本研究中，LC3在成釉細胞瘤組織中的陽性表達率顯著高于正常口腔黏膜組織，差異有統計學意義 （P ＜ 0.05） ，表明成釉細胞瘤中的自噬水平高于正常口腔黏膜組織，提示細胞自噬可能參與牙源性上皮的發生發展，對成釉細胞瘤的形成有一定影響。

研究［12］表明，細胞自噬可通過調節肝癌細胞中的活性氧水平起到促進上皮-間質轉化進而促進腫瘤細胞的轉移作用，并且腫瘤壞死因子α可以通過抑制自噬來抑制上皮-間質轉化。另有研究［13］發現，間質標志物波形蛋白在成釉細胞瘤的上皮細胞中亦有表達，且上皮標志蛋白上皮鈣黏蛋白在成釉細胞瘤上皮細胞中表達下降，提示成釉細胞瘤中存在上皮-間質轉化現象，與成釉細胞瘤的局部侵襲性密切相關。結合本研究結果，成釉細胞瘤中的自噬現象可能影響上皮-間質轉化，對腫瘤的生物學行為產生一定影響。

本研究結果顯示，LC3在發生于下頜骨的成釉細胞瘤中的陽性表達率顯著高于發生于上頜骨及牙齦的成釉細胞瘤，但由于成釉細胞瘤發生于下頜骨者所占比例顯著高于發生于上頜骨及牙齦等部位［14］，且目前尚無對成釉細胞瘤發病部位與腫瘤生物學行為的相關性報道，推測可能由于下頜骨與上頜骨相比，血供較為單一，且骨質較致密，腫瘤細胞在下頜骨中的增殖更易發生缺氧或能量不足，需要細胞自噬為腫瘤細胞增殖提供能量。本研究中發生于上頜骨及牙齦者例數較少，LC3陽性表達率在發病部位上的差異仍需進一步擴大樣本研究。由于復發例數較少，在復發病例與原發病例之間，LC3陽性表達率的差異無統計學意義。但在實性/多囊型成釉細胞瘤中LC3的陽性表達率顯著高于其他分型，有研究［15］發現實性/多囊型成釉細胞瘤的復發率高于其他分型，提示實性/多囊型成釉細胞瘤中自噬水平升高可能與腫瘤復發有關。

綜上所述，自噬標志蛋白LC3在成釉細胞瘤中的陽性表達率高于正常口腔黏膜組織，且與病理分型和發病部位有關，提示成釉細胞瘤中存在細胞自噬現象，自噬現象與成釉細胞瘤的發生發展及其局部侵襲的生物學特性的關系有待進一步研究。