脂肪干細(xì)胞來源外泌體通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)脂肪干細(xì)胞成骨分化

崔夢瑩，郭澍，佟爽，張華，朱夢茹，陳義慶，魏松喬

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科，沈陽 110001）

脂肪干細(xì)胞 （adipose-derived stem cells，ADSCs）能夠分化為成骨細(xì)胞［1］，但僅依賴ADSCs向成骨分化的能力不足以修復(fù)骨缺損。研究［2］發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)組織修復(fù)不僅通過直接分化為靶細(xì)胞起到修復(fù)與替代作用，而且通過成熟細(xì)胞旁分泌機(jī)制刺激鄰近未成熟細(xì)胞受體產(chǎn)生活性。細(xì)胞通過轉(zhuǎn)運必須內(nèi)體分選復(fù)合物 （endosomal sorting complex required for transport，ESCRT） 以胞吐的方式分泌囊泡，該囊泡選擇性包裹蛋白質(zhì)、mRNAs和miRNAs，命名為外泌體 （exosome，EXO）［3］。外泌體參與細(xì)胞間的交流，發(fā)揮修復(fù)再生的功能［4］。近年來，脂肪干細(xì)胞來源的外泌體 （ADSCs-derived exosomes，ADSCs-EXO） 在身體各系統(tǒng)中的再生修復(fù)作用逐漸被證實。

RNARAYANAN等［5］證明EXO可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞系，促進(jìn)骨再生［6-8］。然而，EXO究竟如何發(fā)揮作用目前尚不清晰。研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，Wnt通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生長過程的調(diào)節(jié)，對于ADSCs成骨分化更為重要。因此，推測ADSCs-EXO可能通過激活Wnt/β-catenin通路促進(jìn)ADSCs成骨分化。本研究從驗證ADSCs-EXO促進(jìn)ADSCs成骨分化著手，重點探究其與Wnt/β-catenin通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究于2017年11月至2018年4月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科進(jìn)行，使用抽吸的人大腿皮下脂肪組織 （24歲女性志愿者，身體健康；受試者已簽署知情同意書，且通過倫理委員會審查） 。胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；PBS和DMEM/F12 （1∶1） 購自美國Hyclone公司；Ⅰ型膠原酶和地塞米松磷酸鈉，TritoX-100購自美國Sigma公司；抗壞血酸購自美國Wako公司；抗β-catenin多克隆抗體購自美國CST公司；DKK1購自以色列Prospec公司；堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP） 檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒等購自中國碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 ADSCs的分離培養(yǎng)

抽吸大腿皮下脂肪組織約200 mL，無菌環(huán)境下分裝并洗滌2次，去除大塊纖維組織，以0.1%Ⅰ型膠原酶處理45 min，終止消化后800 r/min室溫離心5 min，重懸離心2次。細(xì)胞懸液均勻種植于75 cm2培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記為P0代。于37 ℃，5% CO2環(huán)境培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%后以一定比例傳代。培養(yǎng)至三代（P3） 備用［11］。

1.3 ADSCs鑒定

1.3.1 ADSCs向成骨分化能力鑒定：待P3代ADSCs細(xì)胞生長至80%～90%時，更換為成骨誘導(dǎo)液，培養(yǎng)21 d后棄上清并洗滌，4%多聚甲醛溶液固定5 min，茜素紅染液染色20 min，倒置相差顯微鏡 （日本Olmpus CX22） 下觀察并拍照。

1.3.2 ADSCs向成軟骨分化能力鑒定：待P3代ADSCs細(xì)胞生長至80%～90%時，消化并重懸，更換為成軟骨誘導(dǎo)液，換液前后100 g室溫離心5 min，28 d后經(jīng)阿爾法藍(lán)染色30 min，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 ADSCs的成骨誘導(dǎo)及EXO分離鑒定

1.4.1 配制成骨誘導(dǎo)液：地塞米松磷酸鈉10-8mol/L+抗壞血酸0.1 mmol/L+ DMEM/ F12。待P3代ADSCs細(xì)胞生長至80%～90%時，更換為成骨誘導(dǎo)液 （不含血清） ，后每隔2～3 d更換成骨誘導(dǎo)液 （含血清） ，交替換液至21 d。收集不含血清的上清液。將上清液2 000 g 4 ℃下離心30 min，棄去沉淀。20 000 g 4 ℃下離心1 h，棄去沉淀，重復(fù)1次。100 000 g 4 ℃下離心1 h，棄去上清，PBS洗滌后重復(fù)1次，棄去上清后200 μ L預(yù)冷PBS重懸，標(biāo)記為ADSCs-EXO。

1.4.2 透射電鏡觀察ADSCs-EXO形態(tài)：取分離純化的10 μ L ADSCs-EXO滴于300目載樣銅網(wǎng)上，3%磷鎢酸溶液負(fù)染1 min，晾干，透射電鏡觀察。

1.4.3 ADSCs-EXO蛋白定量檢測：低溫裂解ADSCs-EXO，按BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。電泳后，根據(jù)分子量截取目的條帶 （CD63：53 000，CD9：28 000） ，濕法轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉室溫孵育2 h，CD63（1∶500） 、CD9 （1∶500） ，4 ℃孵育12 h。二抗 （1∶2 000） 室溫孵育1 h，采用ECL顯影。

1.5 分組

另取P3代ADSCs，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時，以濃度為15 μ g/mL的ADSCs-EXO與其共培養(yǎng)，設(shè)為實驗組 （ADSCs+普通培養(yǎng)液+ADSCs-EXO） ，另外設(shè)置Control組 （ADSCs+普通培養(yǎng)液） ，陽性對照組（ADSCs+成骨誘導(dǎo)液） 和抑制劑組 （ADSCs+普通培養(yǎng)液+ADSCs-EXO+100 ng/mL DKK1） 。

1.6 檢測ADSCs-EXO對ADSCs成骨分化作用

1.6.1 ALP活性檢測：P3代ADSCs均勻接種于24孔板中，每組3個復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時按分組處理，第12天時，棄去上清液，各孔加入0.1%TritonX-100 250 μ L以充分裂解細(xì)胞，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，收集上清液，按試劑盒要求操作，測定405 nm吸光度 （optical density，OD） ，酶活性以O(shè)D值表示。

1.6.2 檢測礦化結(jié)節(jié)：P3代ADSCs均勻接種于12孔板中，每組3個復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞融合至80%～90%時按分組處理，第21天時，棄去上清液，反復(fù)漂洗，4%多聚甲醛2 mL室溫固定5 min，茜素紅染液室溫染色20 min，觀察并拍攝。

1.7 Western blotting檢測各組經(jīng)典Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

于75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)P3代ADSCs，當(dāng)融合約80%～90%時按各組處理，于第7天時收集細(xì)胞，棄去上清液，按BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。電泳后，根據(jù)分子量截取目的條帶 （β-catenin：92×103） ，封閉2 h，β-catenin （1∶1 000） ，4 ℃孵育12 h。二抗（1∶4 000） 室溫孵育1 h，采用ECL顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件對Western blotting 條帶進(jìn)行灰度掃描及半定量分析，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行比較，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs生長特性及鑒定

P3代ADSCs呈長梭形，束狀或漩渦狀排列，胞核位于正中，細(xì)胞輪廓清晰，見圖1。

圖1 P3代ADSCs形態(tài) ×50Fig.1 Morphological assessment of P3-ADSCs ×50

P3代ADSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)至6 d時，部分細(xì)胞形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切危T導(dǎo)培養(yǎng)至12 d時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒狀物，細(xì)胞間可見鈣質(zhì)沉積，14 d時，鏡下可見少量結(jié)節(jié)，21 d茜素紅染色可見橘紅色結(jié)節(jié)。在成軟骨誘導(dǎo)條件下，可見細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)均勻藍(lán)染，表明誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞內(nèi)含有糖胺聚糖 （圖2） 。因此ADSCs能夠向成骨、成軟骨分化，具有多向分化潛能。

圖2 ADSCs的鑒定Fig.2 Identification of ADSCs

2.2 ADSCs-EXO的結(jié)構(gòu)形態(tài)及鑒定

透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，ADSCs-EXO呈現(xiàn)圓形或橢圓形環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有完整的雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑30～100 nm （圖3A） 。離心200 mL上清液可獲得ADSCs-EXO約100 μ g/mL。檢 測ADSCs-EXO與ADSCs的CD9、CD63蛋白表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參，可見ADSCs-EXO特異性蛋白CD9、CD63表達(dá)量明顯 （圖3B） ，進(jìn)一步證明超速離心提取沉淀為ADSCs-EXO。

2.3 ADSCs-EXO對ADSCs成骨分化作用

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)15 μ g/mL ADSCs-EXO對于ADSCs成骨分化作用最強(qiáng)。為評估ADSCs-EXO對ADSCs成骨誘導(dǎo)作用，檢測各組培養(yǎng)12 d后的ALP水平，發(fā)現(xiàn)實驗組ALP活性顯著升高，OD值為2.702±0.13，與空白對照組OD值（1.54±0.247）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。陽性對照組OD值為3.015±0.266，與實驗組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。抑制劑組OD值為2.031±0.06，與實驗組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。

圖3 ADSCs-EXO的形態(tài)觀察及鑒定Fig.3 Morphological assessment and identification of ADSCs-EXO

檢測P3代ADSCs培養(yǎng)21 d后礦化情況，實驗組可見明顯橘紅色鈣化結(jié)節(jié)，但相比于陽性對照組鈣化結(jié)節(jié)較少，而空白對照組未見橘紅色鈣化結(jié)節(jié)，抑制劑組可見礦化結(jié)節(jié)，但數(shù)量較實驗組減少，見圖4。

2.4 Wnt/β-catenin通路影響ADSCs成骨分化

圖4 茜素紅檢測各組礦化結(jié)節(jié)情況 ×100Fig.4 Detection of osteoblast mineralization by alizarin red staining ×100

P3代ADSCs經(jīng)ADSCs-EXO處理后，其Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin表達(dá)量灰度值 （2.539±0.110） 上調(diào)，與空白對照組灰度值 （1.826±0.041） 相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，較陽性對照組蛋白表達(dá)量灰度值 （3.281±0.178） 略低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。加入100 ng/mL DKK1的抑制劑組β-catenin表達(dá)量灰度值 （1.604±0.084） 較實驗組明顯降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＜ 0.01） ，見圖5。

圖5 各組β-catenin蛋白表達(dá)量Western blotting檢測結(jié)果Fig.5 Expression of β-catenin by Western blotting

3 討論

EXO在細(xì)胞交流中起到不可或缺的作用，相比較于直接細(xì)胞療法，EXO具有如下的優(yōu)點： （1） 便于存儲與轉(zhuǎn)移； （2） 無惡變傾向； （3） 免疫排斥可能性較低； （4） 生物效能高； （5） 生物安全性高［12］。間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的EXO能夠修復(fù)受損組織［13］。基于這些因素，本研究提取ADSCs-EXO代替成骨誘導(dǎo)液作用于ADSCs。課題組前期的濃度梯度研究，確定15 μ g/mL的ADSCs-EXO促進(jìn)成骨分化能力較強(qiáng)。

空白對照組ALP活性較低，且茜素紅染色沒有鈣結(jié)節(jié)產(chǎn)生，證明了ADSCs在普通培養(yǎng)基中無成骨分化能力，而在含有ADSCs-EXO的普通培養(yǎng)基中向成骨細(xì)胞分化。與研究者提取成骨細(xì)胞EXO，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化相一致［14］。由于促成骨分化后的ADSCs與成骨細(xì)胞成分及功能相似，EXO中攜帶有促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白及RNAs，因此，ADSCs-EXO被ADSCs內(nèi)化后能夠通過信號通路或調(diào)控基因的方式發(fā)揮促成骨分化的作用，同時當(dāng)ADSCs受ADSCs-EXO影響后向成骨細(xì)胞分化時，也能分泌具有促成骨分化能力的EXO，進(jìn)而加速周圍ADSCs的成骨分化進(jìn)程，形成一個正反饋機(jī)制。

經(jīng)典Wnt/β-catenin通路是參與干細(xì)胞成骨分化的重要通路之一，在ADSCs成骨分化過程中，Wnt家族發(fā)揮重要作用［15-16］。β-catenin是此通路中關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，β-catenin廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，受到Wnt信號激活后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)目標(biāo)基因RUNX2［15-17］，促進(jìn)ADSCs成骨分化。Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK1與LRP5受體結(jié)合，競爭性抑制WNT配體蛋白，影響 β-catenin水平，進(jìn)而影響成骨分化過程［18］。ADSCs-EXO與ADSCs共培養(yǎng)，加入終濃度為100 ng/mL的DKK1時，即可對Wnt通路產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，加入ADSCs-EXO的ADSCs分化過程中β-catenin的水平明顯較高，而當(dāng)加入Wnt/β-catenin抑制劑DKK1后，ADSCs-EXO組β-catenin的表達(dá)水平明顯降低，成骨分化能力減弱。ALP檢測與茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，ADSCs-EXO組水平明顯高于空白對照組，而加入DKK1后ALP水平與礦化結(jié)節(jié)相比于實驗組成骨分化能力降低，但仍較空白對照組強(qiáng)。說明Wnt通路并不是ADSCs-EXO促進(jìn)ADSCs成骨分化過程的唯一通路，ADSCs-EXO通過通路網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)修復(fù)功能，而不是通過單一的通路促進(jìn)組織再生修復(fù)，這些通路有待進(jìn)一步探索。此外，ADSCs-EXO如何取代成骨誘導(dǎo)液發(fā)揮促進(jìn)ADSCs成骨分化的作用，以及ADSCs-EXO中的哪些被分選分子發(fā)揮作用，將有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次證實ADSCs-EXO可以活化ADSCs中的Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)ADSCs成骨分化，并為進(jìn)一步研究干細(xì)胞來源的EXO在促進(jìn)ADSCs成骨分化的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。