穩定過表達人源SAMHD1基因細胞株的建立及其抗病毒活性的研究

武晉英，張洲，李子威，王昊然，操孫潤，李宇恒，宋曉宇，曹流

（中國醫科大學轉化醫學研究院，遼寧省協同創新中心，沈陽 110122）

SAMHD1 （sterile α motif domain and HD domaincontaining protein 1） 蛋白是真核細胞內的一種天然免疫抑制因子［1-2］，HD蛋白結構域具有脫氧核苷三磷酸 （deoxyribonucleoside triphosphate， dNTP） 水解酶活性，可水解病毒RNA、DNA轉錄和復制所必需的原料物質，從而阻斷病毒侵襲宿主細胞、發揮抑制病毒感染的功能［3-8］。SAMHD1基因突變可誘發類似先天性病毒感染的遺傳性自身免疫性疾病、Aicardi-Goutières 綜合征 （Aicardi-Goutières syndrome，AGS）［9-10］。近期研究發現SAMHD1蛋白dNTP水解酶活性可被細胞周期檢驗點激酶磷酸化修飾調節［11］，進而參與細胞周期調控、維系細胞穩態［12］、調節DNA損傷修復進程［13-14］，從而影響腫瘤等疾病的發生與治療［15-16］。為了深入研究SAMHD1蛋白的功能與相關分子機制，急需建立穩定表達SAMHD1蛋白的細胞系。本研究利用慢病毒過表達質粒載體pCDH-EF1- MCS-T2A-copGFP，進行穩定過表達人源SAMHD1基因的結腸癌細胞系構建，并進行1型單純皰疹病毒 （herpes simplex virus type 1，HSV-1） 病毒感染實驗加以驗證，為進一步探索SAMHD1的生物學功能奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、細胞及主要試劑

pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP質粒、慢病毒包裝質粒 （PCMV-dr8.9dvpr418 和 PCMV-VSV-G419）、人結腸癌細胞 （HCT116） 為本實驗室保存；HSV-1購自遼寧佰昊生物科技有限公司；RNAiso PLus、M-MLV反轉錄合成cDNA試劑盒、 PrimerSTAR、 EcoR1、 BamH1、T4 Ligase、E.coli.DH5a購自日本TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自美國Axygen公司；轉染試劑Tubofect transfection購自美國Thermo Scientific公司；Anti-SAMHD1、β-actin 抗體購自英國Abcam公司；其余分子生物學試劑購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養

人結腸癌細胞HCT116用含10%胎牛血清及青霉素 （100 U/mL） 和鏈霉素 （100 U/mL） 的RPMI 1640培養基，置于37 ℃、5% CO2孵箱培養，根據細胞的生長情況進行傳代，調整好細胞狀態備用。

1.3 總RNA的提取及cDNA合成

運用Trizol法提取HCT116細胞中的總RNA，在ThermoNanodrop濃度分析儀上測定總RNA濃度，然后利用cDNA合成試劑盒，逆轉綠合成cDNA，將其暫存于-20 ℃備用。

1.4 PCR擴增與重組質粒構建

根據GENBANK中的人源SAMHD1基因序列，設計SAMHD1引物：F，CCGGAATTCATGCAGCGAGC CGATTC； R，CGGGATCCTCACATTGGGTCATCT。以1.3中合成的cDNA為模板擴增SAMHD1全長編碼區序列。純化PCR產物，并將其與pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP質粒分別用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性核酸內切酶進行酶切，最后利用T4 Ligase將SAMHD1片段與pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP載體連接，構建重組質粒PCDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP。重組質粒經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切初步鑒定，送測序驗證。

1.5 穩定表達人源SAMHD1細胞株構建

1.5.1 表達人源SAMHD1的慢病毒制備：分別將4.4 μ g PCMV-dr8.9dvpr418、2.2 μ g PCMV-VSV-G419、3.4 μ g pCDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP或pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP 質粒稀釋于1 mL無血清DMEM，加入20 μ L Tubofect轉染試劑，立即混勻并低速離心，室溫放置15～20 min，將上述混合液加入準備好的293T細胞，6 h后更換細胞培養液，24、48、72 h分別收集上清，2 000 r/min離心10 min去除細胞碎片，上清即為含有 pCDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP或pCDHEF1-MCS-T2A-copGFP 的病毒液。收集上清并加入適量PEG-it于4 ℃混轉過夜，4 000 r/min離心30 min，500 μ L PBS重懸沉淀，4 ℃保存備用。

1.5.2 穩定表達人源SAMHD1細胞株建立：用1.5.1中制備的病毒 （100 μ L） 感染細胞 （培養皿直徑=35 mm） ，密度約40% （1×105/皿） 的HCT116細胞，24 h后重復感染，48 h后正常培養。

1.5.3 穩定表達人源SAMHD1細胞株鑒定：冰上制備穩定表達SAMHD1的116細胞總蛋白樣。Western blotting檢測目的蛋白表達。

1.6 穩定表達SAMHD1細胞株的抗HSV-1病毒作用檢測

首先進行HSV-1病毒擴大培養，用10 cm直徑培養皿培養Hela細胞，密度達到100% （約1×107/皿） 后更換培液，加入新鮮培養基9 mL，再加入1 mL HSV-1病毒液。48～72 h收取上清，1 000 r/min離心 5 min，取上清，4 ℃冰箱短期保存。然后培養HCT116細胞，密度50%～70% （約7×106/皿） 時感染病毒 （培養基∶病毒液=9∶1） ，病毒感染12 h后換液。HSV-1病毒用綠色熒光蛋白 （green fluorescent protein，GFP） 標記。在熒光顯微鏡下觀察并記錄HSV-1感染0、12、24、36、48 h后情況，收集感染后細胞進行蛋白印記實驗，檢測病毒感染的標志性蛋白 （HSV-GD） 來評價過表達細胞株的抗病毒作用。

2 結果

2.1 重組質粒的構建及鑒定結果

結果顯示，以合成的cDNA為模板采用特異性引物進行PCR擴增，把PCR產物連接到慢病毒表達載體pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP上，構建出重組質粒pCDH-EF1-MCS-SAMHD1- T2A-GFP。將重組質粒經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，片段大小約為1 800 bp，與SAMHD1片段長度相符，見圖 1。DNA測序結果證明SAMHD1基因插入方向及讀碼框正確，表明重組質粒構建成功，見圖2。

2.2 穩定表達SAMHD1的細胞株建立及鑒定

圖1 重組質粒酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Restriction enzyme digestion results of the recombinant plasmid identified by agarose gel electrophoresis

圖2 重組質粒測序結果圖Fig.2 Sequencing chromatogram of the recombinant plasmid

將pCDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP和pCDHEF1-MCS-T2A-copGFP的假病毒感染HCT116細胞，感染2次后更換為正常培養基培養。細胞裂解液裂解感染后的細胞。Western blotting檢測結果顯示，感染pCDH-EF1-MCS- SAMHD1-T2A-GFP病毒細胞在72×103位置條帶亮度明顯增強，SAMHD1蛋白的相對表達量為1.108±0.066； 而空白對照HCT116細胞和感染pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP病毒液細胞在72×103位置未見條帶亮度明顯改變，SAMHD1蛋白相對表達量分別為0.708±0.043和0.719±0.011，見圖3。表明穩定過表達SAMHD1的HCT116細胞株構建成功。

2.3 穩定表達 SAMHD1 細胞株抗病毒功能評價

圖3 Western blotting 檢測HCT116細胞中SAMHD1 蛋白表達Fig.3 Western blotting results of SAMHD1 protein expression in HCT116 cells

利用HSV-1 GFP病毒對目的細胞進行0、12、24、36、48 h感染，觀察目的細胞中GFP熒光強度的高低變化確定感染時間，結果發現，36 h病毒感染效率最高。pCDH+HSV-1與未感染病毒pCDH組比較，感染組GFP熒光亮度明顯增高，說明感染成功。但是同樣都進行病毒感染的pCDH+ SAMHD1+ HSV-1組與pCDH+ HSV-1組細胞比較，GFP熒光亮度卻未見明顯增高，見圖4A。結果顯示，與pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP的HCT116細胞 （相對表達量為11.509±0.607 ）比較，穩定表達pCDH-EF1-MCS-SAMHD1-T2A-GFP細胞 （相對表達量為1.234±0.072 ） GFP表達明顯較少。同時收集感染后細胞進行蛋白印記實驗，檢測病毒感染的標志性蛋白 （HSV-GD） 表達來評價過表達細胞株的抗病毒作用。蛋白印記實驗結果也證明過表達SAMHD1細胞中病毒感染的標志性蛋白HSV-GD表達較低，見圖4B。以上實驗結果均表明慢病毒介導的過表達SAMHD1基因的結腸癌細胞株能夠有效抑制HSV-1復制。

3 討論

2011年，研究［17］證實SAMHD1是一種有效的人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（human immunodeficiency virus-1，HIV-1）限制因子。作為目前發現唯一的dNTP水解酶，SAMHD1通過調控脫氧核糖核苷三磷酸的含量來限制非循環細胞中的HIV-1感染，并且能夠阻斷細胞中逆轉錄病毒的轉錄過程和DNA病毒的復制［5-6，18］。隨后人們對其抗病毒功能進行了大量研究，dNTP是細胞、寄生蟲和病毒DNA聚合酶的通用底物［19］，因此細胞dNTP含量幾乎影響所有dsDNA病毒的基因組復制，目前認為SAMHD1維系核苷酸含量的動態平衡可能是細胞限制各種病毒復制的一般機制。

圖4 過表達 SAMHD1 細胞系的抗病毒功能評價Fig.4 Evaluation of the antiviral function of the cell line overexpressing SAMHD1 gene

瞬時轉染存在表達效率不一致且外源基因表達會隨細胞生長繁殖而逐漸降低，無法傳到子代，臨床研究［20］證明單純皰疹病毒 （herpes simplex virus，HSV） 是人類最常見的病原體，人是唯一的自然宿主，本研究選擇人結腸癌細胞作為工具細胞，通過瓊脂糖凝膠實驗及測序結果證明重組質粒構建成功。利用慢病毒包裝系統建立SAMHD1的穩轉細胞株，Western blotting檢測結果表明穩定過表達SAMHD1的細胞株構建成功。免疫熒光和Western blotting結果證明穩定過表達SAMHD1可以有效抑制HSV-1在結腸癌細胞系中的復制，且證實本實驗所構建的穩定過表達SAMHD1細胞株具有SAMHD1的生物學功能。

SAMHD1具有廣泛的抗病毒功能，能夠有效抑制DNA病毒HSV-1在結腸癌細胞中的復制。但是SAMHD1是否對其他類型病毒及在其他細胞中有同樣的生物學功能，還需進一步探討。本研究為深入研究SAMHD1蛋白的生物學功能提供實驗保障。