散發性乳腺癌與BRCA2基因rs206115位點多態性的相關分析

馬金柱，趙鐵映，劉明，張瑞，布日古德

（內蒙古醫科大學附屬醫院普通外科，呼和浩特 010050）

研究［1］顯示，乳腺癌發病率居女性惡性腫瘤發病首位，遺傳、免疫及環境等因素共同作用導致乳腺癌發生。在與遺傳相關的乳腺癌中發現乳腺癌易感基因1 （breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）和乳腺癌易感基因2 （breast cancer susceptibility gene 2，BRCA2） 突變廣泛存在［2］。HEDAU等［3］研究發現，3期以上乳腺癌患者中BRCA1表達下降，但在BRCA1低表達或無表達乳腺癌患者中BRCA2高表達。目前，BRCA2對散發性乳腺癌的作用及其相關性仍不清楚。本研究選擇BRCA2基因rs206115位點，探討內蒙古地區蒙古族和漢族乳腺癌患者基因型分布差異，為乳腺癌的早期篩查及預防提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及分組

收集2015年12月至2016年12月就診于內蒙古醫科大學附屬醫院乳腺外科并經病理確診的原發性散發性乳腺癌患者101例 （病例組，蒙古族39例、漢族62例） ，良性乳腺疾病患者101例 （對照組，蒙古族39例、漢族62例） 。所有患者均知情同意。病例組年齡22～80歲，平均年齡 （45.53±13.70） 歲，對照組年齡19～74歲，平均年齡 （46.08±14.29） 歲，2組年齡差異無統計學意義 （t = -0.276，P = 0.782） 。抽取患者空腹外周靜脈血 （2 mL） ，采血管使用乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 抗凝真空采血管，顛倒混勻并編號后-80 ℃冰凍保存備用。篩選標準： （1） 病例組，①患者原籍屬于內蒙古地區，長期居住工作在此地區 （祖上三代內居住于內蒙古地區） ，無親緣關系、無其他民族通婚史及一級親屬無乳腺癌家族病史的蒙古族及漢族女性患者；②經手術及病理確診的原發性乳腺癌患者 （排除原位癌、雙側乳腺癌和合并其他惡性腫瘤） ；③抽血前均未經任何抗腫瘤治療 （放療+化療） ；④無職業致癌物接觸史。 （2） 對照組，①患者原籍屬于內蒙古地區，長期居住工作在此地區 （祖上三代內居住于內蒙古地區） ，無親緣關系、無其他民族通婚史蒙古族及漢族女性患者；②均通過體檢或病理組織學等手段確診，未檢出患有腫瘤相關疾病；③無職業致癌物接觸史。

1.2 實驗方法

使用血液基因組DNA提取試劑盒 （SK8224） 進行基因組DNA提取。提取的 DNA -20 ℃保存。BRCA2基因位點擴增引物委托上海生工有限公司合成。rs206115位點的特異性擴增引物：F，5'-GGCTGAAT AGGGTTTGTTGTAAG-3' ； R，5'-CCAAAGCAGAATG CCTAACTC-3'；擴增片段長度330 bp。反應液混勻后在PCR儀上擴增，預變性95 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火55～60 ℃ 35 s，延伸72 ℃ 40～50 s，修復延伸72 ℃ 5～8 min，循環35次，最后鑒定PCR產物及產物測序。

1.3 統計學分析

采用Excel2003建立數據庫。BRCA2基因rs206115位點各基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。采用SPSS17.0軟件對實驗數據及臨床病理特征［包括年齡、病理類型、淋巴結轉移、雌激素受體（estrogen receptor，ER） 、孕激素受體 （progesterone receptor，PR） 、人表皮生長因子受體2 （human epidermal growth factor receptor-2，Her-2） 及臨床分期］進行統計。計數資料組間比較采用χ2檢驗，不滿足χ2檢驗條件的采用秩和檢驗；計量資料用s表示，組間比較采用 t 檢驗，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組一般資料比較

結果顯示，病例組蒙古族和漢族樣本在年齡分層、病理類型、淋巴結轉移、ER、PR、Her-2及臨床分期的分布差異無統計學意義（均P ＞ 0.05），見表1。對照組在年齡分層中 （＜35歲，蒙古族7例，漢族21例；35～＜60歲，蒙古族22例，漢族27例；≥60歲，蒙古族10例；漢族14例） 差異無統計學意義 （χ2=3.100，P =0.212） 。

2.2 各組BRCA2基因rs206115位點比較

結果顯示，BRCA2基因rs206115位點可檢測出3 種基因型：AA、 AG、 GG型，見圖1。BRCA2基因rs206115位點基因多態性2組比較差異無統計學意義 （χ2=3.490，P = 0.175） 。 BRCA2基因rs206115位點各基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡檢驗（P = 0.173） ，具有群體代表性。見表2。

病例組A等位基因頻率為74.75%，G等位基因頻率為25.25%；對照組A等位基因頻率為65.35%，G等位基因頻率為34.65%。與對照組比較，病例組BRCA2基因rs206115位點等位基因A分布頻率顯著增高 （χ2=4.259，P = 0.039） 。見表3。

3 討論

乳腺癌是由基因因素 （基因的遺傳多態性、基因突變等） 和非基因因素 （民族差異、生活習慣、致癌物接觸等） 共同作用引起，2種因素都參與了乳腺癌的發生發展［4］。BRCA2基因是腫瘤抑制基因，位于人類染色體13q12.3，含有27個外顯子，共編碼3 418個氨基酸，BRCA2中已發現超過1 800種突變，BRCA2基因改變與乳腺癌的發生密切相關［5］。CAROLINE等［6］學者在研究BRCA1、BRCA2與乳腺癌關系時發現沒有任何單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP） 和乳腺癌顯著關聯；JANE等［7］發現BRCA1突變攜帶者中BRCA2 rs206115位點降低雙側乳腺癌患病風險，而在非BRCA1突變攜帶者中rs206115位點與雙側乳腺癌患病風險之間未表現出明顯的關系，這提示BRCA2基因影響乳腺癌的發生發展及預后可能是多個基因共同合作的結果；劉璐等［8］研究發現rs206115基因型與患者復發率表現出明顯相關；筆者以往研究［9］也發現BRCA2蛋白異常表達在散發性乳腺癌發生、發展過程中起著一定作用。因此本研究選擇BRCA2基因rs206115位點進行研究。

表1 病例組一般情況比較Tab.1 Comparison of general characteristics in the case group

圖1 BRCA2 rs206115 AA、AG、GG基因型Fig.1 Genotypes of BRCA2 gene rs206115 loci

表2 各組BRCA2基因 rs206115位點基因型比較［n （%） ］Tab.2 Genotypes of BRCA2 gene rs206115 loci compared in each group ［n （%） ］

表3 病例組與對照組BRCA2 rs206115位點等位基因頻率比較Tab.3 Allele frequency of BRCA2 gene rs206115 loci in case and control groups

目前已發現有超過200種BRCA1和BRCA2基因變異，有的變異直接致病，有的變異是非致病的，這些變異是導致乳腺癌多樣性的原因之一［10］。SHIMELIS等［10］研究發現 BRCA2基因變異 （c.7522G＞A、p.Gly2508Ser） 增加了亞洲女性患乳腺癌的風險，而BRCA2基 因 中c.4258G＞T、p.Asp1420Tyr、c.8149G＞T與白種人乳腺癌呈負相關。王雯等［11］在對維吾爾族和漢族散發性乳腺癌患者BRCA1/2突變情況研究時發現BRCA1基因突變檢出率高于BRCA2基因，這可能與新疆地區散發性乳腺癌發生相關。研究［12］發現良性乳腺病變中可能已存在一定的BRCA2突變累積，這增加了散發性乳腺癌的患病風險。不同地區、不同種族民族之間基因突變位點、突變頻率、蛋白表達不盡相同，本結果顯示在散發性乳腺癌中，與對照組比較，病例組rs206115位點等位基因A分布頻率顯著增高 （χ2=4.259，P = 0.039） ，rs206115的A基因可能是蒙漢族散發性乳腺癌的易感基因之一。A基因可能影響相關基因表達及蛋白質功能，增加了患乳腺癌的風險，本結果有民族特異性，是多種因素 （生活方式、激素水平及其他遺傳因素等） 參與的結果。研究證明［13］SNP導致等位基因差異性表達，能部分解釋表型不同與乳腺癌、胃癌等癌癥的發生相關，這種差異性表達可能影響、調節細胞周期和細胞功能，引起細胞凋亡、泛素化，從而導致細胞喪失腫瘤抑制功能。本研究表明rs206115位點A等位基因的差異性表達與散發性乳腺癌具有相關性，但其具體細胞分子機制仍待進一步探究。目前，研究［14］已表明攜帶BRCA1或BRCA2基因突變的女性有患乳腺癌的高風險，因此在今后的臨床工作中應盡早識別BRCA2基因rs206115位點的A等位基因，并與其他變異基因聯合分析，使之成為乳腺癌風險評估的有效手段。

綜上所述，BRCA2基因rs206115的A基因可能是蒙漢族散發性乳腺癌的易感基因之一。本研究樣本量較少，在民族大融合的背景下，蒙古族生活習慣及飲食等方面都趨于漢化，蒙漢之間的差異減小，另外多種基因位點共同參與乳腺癌的發生發展。因此今后需擴大樣本，同時增加對乳腺病變不同時期基因和病理組織的研究，以期進一步肯定BRCA2基因rs206115位點與散發性乳腺癌的相關性，同時找出更多散發性乳腺癌相關性位點，為乳腺癌的基因檢測奠定基礎。